Tryptase-Inhibitoren induzieren die Expression von Tryptase β in humanen Mastzellen

Ullrich, Fabian Thomas Hermann (2026): Tryptase-Inhibitoren induzieren die Expression von Tryptase β in humanen Mastzellen: ein regulatorischer Feedbackmechanismus?. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine

Abstract

Mastzellen haben als Effektorzellen hämatopoetischen Ursprungs zentrale Aufgaben in der angeborenen und adaptiven Immunität. Neben de no synthetisierten Mediatoren vermitteln insbesondere die in sekretorischen Granula gelagerten Enzyme, Zytokine und Amine die komplexen Mastzellfunktionen. Einer der Granula-assoziierten Schlüsselmediatoren ist die tryptische Serinprotease Tryptase β, die vollständig aktiv als Heparin-stabilisiertes Tetramer gelagert wird. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass diese Protease an der Pathogenese einer Vielzahl Mastzell-vermittelter Erkrankungen aus dem allergisch-atopischen Formenkreis wie dem Asthma bronchiale und an entzündlich-rheumatischen Krankheitsbildern beteiligt ist. Während Antihistaminika und Mastzellstabilisatoren als etablierte Pharmaka im Einsatz sind, bietet sich mit Tryptaseinhibitoren eine neue Substanzklasse an, deren klinischer Erfolg bisher jedoch ausblieb. Weshalb die klinischen Studien mehrerer Inhibitoren und eines inhibitorischen Antikörpers scheiterten, ist nicht geklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Effekt strukturell diverser Inhibitoren auf Tryptase β in Lösung mit deren Wirkung auf Tryptase in kultivierten Mastzellen zu vergleichen. Dazu wurde die Hemmung von Tryptase β in zellfreien in vitro-Versuchen mit rekombinanter Tryptase und Tryptase in Mastzelllysaten sowie in einem zellbasierten Modell mit humanen HMC-1-Mastzellen untersucht. Klassische hemmkinetische Versuche mit rekombinanter Tryptase β bestätigten ein breites Spektrum an Affinitäten (Ki 4 ± 1 x 10^-12 M bis 2,5 ± 0,5 × 10^-5 M), Assoziations- bzw. Dissoziationsgeschwindigkeiten (kon < 10 /M/s bis > 8,3 ± 0,17 × 10^6 /M/s bzw. koff < 1,4 × 10^-5 /s bis > 2,1 ± 0,4 × 10^2 /s) und daraus resultierender Enzym-Inhibitor-Komplexhalbwertszeiten (t1/2diss < 3,3 × 10^-3 s bis > 5 × 10^4 s) der eingesetzten Hemmstoffe, die damit eine repräsentative Auswahl derzeit verfügbarer Tryptaseinhibitoren darstellen. Hemmkinetiken mit Tryptase in HMC-1-Mastzelllysaten waren mit Ausnahme weniger quantitativer Unterschiede weitgehend identisch; die Tryptasehemmung durch Inhibitoren wird also durch andere Mastzell-Bestandteile nicht wesentlich beeinflusst. Die Kultivierung von HMC-1-Mastzellen mit den Inhibitoren zeigte, dass die Substanzen auch die intrazelluläre Tryptaseaktivität hemmen, also mutmaßlich die Zell- und Granulamembranen penetrieren. Allerdings unterscheiden sich Ausmaß und Dynamik der Hemmung z.T. deutlich von den zellfreien Versuchen. Eine intrazelluläre Hemmung ist nur bei Substanzen nachweisbar, die stabile Komplexe mit der Protease bilden. Hierzu zählen irreversible (AEBSF) und reversible (z.B. Nafamostat) synthetische sowie größere proteinerge Inhibitoren (z.B. rLDTI). Dagegen werden Hemmstoffe wie Benzamidin und Gabexat, deren Komplexe mit Tryptase rasch dissoziieren (t1/2diss < 3,3 ms bzw. < 2,8 s), bei der Analytik so weit verdünnt, dass keine Hemmung mehr nachweisbar ist. Überraschend induzieren diese Inhibitoren in HMC-1 jedoch nach 5 h einen Anstieg der Tryptaseaktivität auf bis zu 150 % der Kontrolle. Weiterführende Versuche und verlängerte Kulturzeiten zeigen, dass Benzamidin konzentrations- und zeitabhängig die Tryptaseaktivität in HMC-1 induziert, die innerhalb von 96 h ansteigt, über eine 10-tägige Kultur ein Plateau bei ca. 720±60 % der Kontrolle erreicht und mit vergleichbarer Dynamik reversibel ist. Neben Benzamidin erhöhen auch dessen inhibitorisch aktiven Derivate die Tryptaseaktivität, nicht aber ein inhibitorisch inaktives; der Zusammenhang mit der Affinität der Derivate legt nahe, dass die Hemmung selbst die Induktion antreibt. Nach verlängerter Kultur ist der Tryptaseanstieg auch mit Nafamostat (616±70 %), AEBSF (134±10%) und APC-366 (160±15%) nachweisbar, nicht jedoch mit rLDTI; der Abbau metabolisch instabiler Inhibitoren demaskiert den initial nicht nachweisbaren Aktivitätsanstieg, während stabile Agonisten mit langer t1/2diss die Messung der Aktivität stören. Die Tryptase-Quantifizierung mit alternativen Methoden wie Western Blot und ImmunoCAP® bestätigt, dass alle Inhibitoren zu einem Anstieg intrazellulärer Tryptase führen. Mittels RT-qPCR kann letztlich eine vermehrte Genexpression durch den Anstieg der Tryptase β-Transkripte um 30 % relativ zu GAPDH nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzfärbungen visualisieren den Tryptaseanstieg in den HMC-1-Granula bei ansonsten unveränderter Zytomorphologie. Die Mengen der ebenfalls Granula-assoziierten Mediatoren Heparin und β-Hexosaminidase sind unverändert, die von Histamin verringert zugunsten einer Zunahme im Medium. Eine vermehrte Zymogen-Aktivierung durch Cathepsin C, eine (Trans-)Differenzierung der HMC 1 Zellen und eine relevante Zytotoxizität konnten als Ursache weitgehend ausge-schlossen werden. Pilotversuche mit der niedrig Tryptase-exprimierenden myelomonozytären Zelllinie U-937 bestätigen die Tryptaseinduktion durch Inhibitoren über Mastzellen hinaus. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass klassische hemmkinetische Analysen mit Tryptase β die Inhibition der Protease in Mastzellen nicht adäquat vorhersagen. Darüber hinaus führt die intrazelluläre Hemmung von Tryptase zur Induktion ihrer Expression mit konsekutivem Anstieg von Proteinmenge und Aktivität. Dieser hier erstmals beschriebene Feedbackmechanismus in der Homöostase von Tryptase könnte das wiederholte Scheitern klinischer Studien von Tryptaseinhibitoren erklären. Erkenntnisse zur Tryptaseregulation sollten bei der Entwicklung zukünftiger Hemmstoffe berücksichtigt werden und eröffnen neue Ansatzpunkte für die gezielte Therapie Tryptase-assoziierter Erkrankungen.

Abstract

Mast cells are effector cells of hematopoietic origin and play a central role in innate and adaptive immunity. In addition to de novo-synthesized mediators, the enzymes, cytokines, and amines stored in their secretory granules chiefly mediate the complex mast cell functions. One granule-associated key mediator is the tryptic serine protease tryptase β, which is stored as a fully active heparin-stabilized tetramer. Numerous studies suggest that this protease contributes to the pathogenesis of a broad range of mast cell-mediated disorders within the allergic-atopic spectrum, such as bronchial asthma, and to inflammatory-rheumatic diseases. While antihistamines and mast cell stabilizers are established drugs, tryptase inhibitors constitute a new class whose clinical success has thus far remained elusive. The reasons for the failure of clinical trials of several inhibitors and an anti-tryptase antibody are unknown. This study aimed to compare the effects of structurally diverse inhibitors on tryptase β in solution with their effects on tryptase in cultured mast cells. For this purpose, inhibition of tryptase β was examined in cell-free in vitro assays using recombinant tryptase and tryptase in mast cell lysates, as well as in a cell-based model with human HMC-1 mast cells. Classical inhibition kinetics with recombinant tryptase β confirmed a wide spectrum of affinities (Ki 4 ± 1 × 10^-12 M to 2.5 ± 0.5 × 10^5 M), association and dissociation rate constants (kon < 10 /M/s to > 8.3 ± 0.17 × 10^6 /M/s; koff < 1.4 × 10^-5 /s to > 2.1 ± 0.4 × 10^2 /s), and resulting enzyme-inhibitor dissociation half-lives (t1/2diss < 3.3 × 10^-3 s to > 5 × 10^4 s), constituting a representative selection of currently available tryptase inhibitors. Inhibition kinetics with tryptase in HMC-1 mast cell lysates were largely identical apart from minor quantitative differences; thus, other mast cell constituents do not substantially affect inhibitor-mediated tryptase inhibition. Culturing HMC-1 mast cells with the inhibitors showed that these compounds also inhibit intracellular tryptase activity, presumably penetrating the cell and granule membranes in the process. However, the extent and dynamics of inhibition in some cases differed markedly from the cell-free assays. Intracellular inhibition was detectable only with compounds forming stable complexes with the protease. These included irreversible (AEBSF) and reversible (e.g., nafamostat) synthetic inhibitors as well as larger proteinaceous inhibitors (e.g., rLDTI). By contrast, inhibitors such as benzamidine and gabexate, whose complexes with tryptase dissociate rapidly (t1/2diss < 3.3 ms and < 2.8 s, respectively), are diluted during the assay protocol to an extent that inhibition is no longer measurable. Unexpectedly, these inhibitors increase tryptase activity in HMC-1 to as much as 150 % of untreated controls after 5 h. Follow up experiments and prolonged cell culture demonstrate that benzamidine induces HMC-1 tryptase activity in a concentration- and time-dependent manner, rising within 96 h, reaching a plateau of ~ 720 ± 60 % of untreated controls over a 10-day culture period, and returning to baseline with similar kinetics after inhibitor withdrawal. In addition to benzamidine, its inhibitory derivatives also increase tryptase activity, whereas a non-inhibitory compound does not; the correlation with the derivatives’ affinity suggests that the inhibition itself drives the induction of tryptase. After prolonged culture periods, increases in tryptase are also detectable with nafamostat (616±70 %), AEBSF (134±10 %), and APC 366 (160±15 %), but not with rLDTI; the metabolic degradation of unstable inhibitors unmasks the initially undetectable rise in activity, whereas stable agents with a long t1/2diss directly interfere with activity measurements. Quantification by alternative methods, including Western blot and ImmunoCAP®, confirms that all inhibitors lead to an increase in intracellular tryptase. Finally, RT-qPCR experiments demonstrate increased gene expression, with tryptase β transcripts rising by 30 % relative to GAPDH. Immunofluorescence staining visualizes the tryptase increase in HMC-1 granules, while cytomorphology otherwise remains unchanged. The levels of the other granule-associated mediators, heparin and β-hexosaminidase, are unaltered, whereas histamine decreases intracellularly in favor of an increase in the cell culture medium, suggesting histamine release. Enhanced zymogen activation by cathepsin C, (trans )differentiation of HMC-1 cells, and relevant cytotoxicity were largely excluded as causes for tryptase upregulation. Pilot experiments with the low-tryptase-expressing myelomonocytic cell line U-937 confirm the tryptase induction by inhibitors beyond mast cells. In summary, classical inhibition kinetics with tryptase β do not adequately predict protease inhibition in mast cells. Moreover, intracellular inhibition of tryptase induces its expression, leading to an increase of tryptase protein and activity. This regulatory feedback mechanism in tryptase homeostasis – described here for the first time – may explain the repeated failure of clinical trials of tryptase inhibitors. Understanding tryptase regulation should inform the development of future inhibitors and opens new avenues for targeted therapy of tryptase-associated diseases.

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Keywords: Mastzellen, Tryptase β, Tryptaseinhibitoren, Serinproteasen, Tryptaseregulation
• Subjects: 600 Technology, Medicine; 600 Technology, Medicine > 610 Medical sciences and medicine
• Faculties: Faculty of Medicine
• Language: German
• Date of oral examination: 16. July 2026
• 1. Referee: Sommerhoff, Christian
• Signature of the printed copy: 0700/UMD 22933