Improving the cytotoxicity of CAR-T cells using synthetic cytokine signals

Schwarz, Dominic (2026): Improving the cytotoxicity of CAR-T cells using synthetic cytokine signals. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy

Abstract

CAR-T therapy is a clinically validated therapeutic modality that promises long-term curative effects in patients suffering from hematologic malignancies. Early positive clinical results in the treatment of gastrointestinal cancers, prostate cancers, and glioblastoma suggest that future generation chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapies may be viable treatment options for solid tumors. Still, the hostile tumor microenvironment remains a significant hurdle that constricts immune cell infiltration and persistent tumor rejection. Cytokines are potent immune mediators with the capacity to reprogram and inflame tumors, thus potentiating the endogenous anti-cancer immunity manifold. This thesis documents the design, characterization, and comparison of novel concepts that activate cytokine pathways in CAR-T cells through three key mechanisms of action: switch receptors, orthogonal receptors, and cytokine-armoring. The first project addresses the immune suppression within the tumor microenvironment by exploiting tumor-associated IL23. Informed by IL23 prevalence data from organoids, humanized mouse models, and clinical patient samples, a novel chimeric IL23-IL12 switch receptor (IL23sR) was designed to act as a scavenger of IL23 and instead generate a proinflammatory IL12-like cytotoxic cellular response. In chronic antigen exposure experiments, CEACAM5-targeted CAR-T cells equipped with IL23sR outperformed second-generation CAR-T cells, exhibiting long-term polyfunctional cytokine release and high proliferative capacity. In vivo studies illustrated that these engineered cells lead to enhanced and prolonged anti-tumor efficacy, characterized by an effector memory T cell population with an NK-like phenotype. The second project describes the creation of an orthogonal receptor platform (DOTAM receptors) to enable precise, external control over cytokine signaling. Using an inert small-molecule ligand and antibody-based heterodimerization domains, this platform avoids baseline activity and cross-reactivity with endogenous receptors. As a proof-of-concept, CEACAM5-targeted CAR-T cells were engineered with a DOTAM-IL12 receptor (D12R). These cells demonstrated DOTAM-dependent, sustained cytotoxicity and increased tumor infiltration in murine xenograft models. Beyond IL12, the project exemplified the platform's modularity by designing functional orthogonal receptors for the IL18, IL23, IL27, IL35, and IL39 pathways, providing a tunable framework to augment therapeutic efficacy while potentially limiting systemic toxicities. The third project focuses on T cells Redirected for Universal Cytokine-mediated Killing (TRUCKs), which utilize an activation-dependent promoter (NFAT6-IL2p) to drive precision cytokine secretion upon antigen recognition. A library of rationally designed bicistronic lentiviral gene layouts was screened to minimize background activity of the inducible promoter and maximize its inducibility. While bidirectional constructs were explored, monodirectional frameworks were most potent for delivering IL12 and IL18 payloads. Notably, the IL18 pathway proved to be highly effective when exploited through these logic-gates, even outperforming recombinant IL18 and IL12. To further reduce systemic exposure of IL18, a membrane-bound, decoy-resistant IL18 variant was conceived and characterized, showing resistance to the natural inhibitor IL18BP. Comparative analysis of all projects revealed that IL12 and IL18 pathways are particularly potent in potentiating CAR-T cytotoxicity in solid tumor models. Intriguingly, superior tumor growth control was often mediated by CAR-T cell populations characterized by high expression of inhibitory surface proteins (e.g., PD1, Lag3, Tim3), challenging canonical markers of T cell exhaustion. These findings demonstrate how cytokines can potentiate the cytotoxicity of CAR-T cells and how orthogonal or switch-based receptor designs can isolate specific pathway contributions to improve our understanding of immune functions in cancer. The findings presented in this thesis exemplify how future generation engineered T cells can be used to study the immune system in new ways and how cytokines can potentiate the cytotoxicity of CAR-T cells in solid tumor therapies.

Abstract

Zelltherapien sind eine klinisch etablierte Therapieform und versprechen langanhaltende, potenziell kurative Behandlungen von Blutkrebspatienten. Erste, vielversprechende klinische Daten aus der Behandlung gastrointestinaler Tumore, des Prostatakarzinoms und des Glioblastoms legen nahe, dass CAR‑T‑Zelltherapien der nächsten Generation auch bei der Therapie solider Tumore eine realistische Option sein könnten. Allerdings bleibt die Tumormikroumgebung ein zentrales Hindernis: Es begrenzt die Infiltration von Immunzellen und erschwert eine dauerhafte Tumorwachstumskontrolle. Diese Dissertation dokumentiert das Design, die Charakterisierung und den Vergleich neuartiger Konzepte, die Zytokinsignalwege in CAR-T-Zellen über drei zentrale Wirkmechanismen aktivieren: Switch-Rezeptoren, orthogonale Rezeptoren und die Bewaffnung mit Zytokinen („Cytokine-Armoring“). Das erste Projekt adressiert die Immunsuppression innerhalb der Tumormikroumgebung durch die Nutzung von tumorassoziiertem IL23. Basierend auf generierten Daten zur IL23-Prävalenz aus Organoiden, humanisierten Mausmodellen und klinischen Patientenproben wurde ein neuartiger chimärer Switch-Rezeptor (IL23sR) entwickelt, der als „Scavenger“ für IL23 fungiert und stattdessen eine proinflammatorische, IL12-ähnliche zytotoxische Antwort auslöst. In Experimenten mit chronischer Antigenrestimulierung zeigen CEACAM5-spezifische CAR-T-Zellen, die mit IL23sR ausgestattet waren, Vorteile gegenüber herkömmlichen CAR-T-Zellen. Der Effekt wurde maßgeblich durch eine langfristige polyfunktionale Zytokinfreisetzung sowie eine hohe Proliferationskapazität mediiert. In-vivo-Studien verdeutlichten die verbesserte und verlängerte Anti-Tumor-Wirksamkeit dieser Zellen, die durch eine Effektor-Gedächtnis-T-Zellpopulation („T-cell effector memory phenotype“) mit einem NK-ähnlichen Phänotyp gekennzeichnet sind. Das zweite Projekt beschreibt die Erfindung einer orthogonalen Rezeptorplattform (DOTAM-Rezeptoren), um eine präzise Kontrolle über die Zytokinsignalisierung zu ermöglichen. Unter Verwendung eines inerten, Liganden und antikörperbasierter Heterodimerisierungsdomänen vermeidet diese Plattform unspezifische Aktivität und Kreuzreaktivität mit endogenen Rezeptoren. Als „Proof-of-Concept“ wurden CEACAM5-spezifische CAR-T-Zellen mit einem DOTAM-IL12-Rezeptor (D12R) modifiziert. Diese Zellen zeigten eine DOTAM-abhängige, anhaltende Zytotoxizität und eine erhöhte Tumorinfiltration in immunodefizienten murinen Xenotransplantatmodellen. Über IL12 hinaus demonstrierte das Projekt die Modularität der Plattform durch das Design funktionaler orthogonaler Rezeptoren für die IL18-, IL23-, IL27-, IL35- und IL39-Signalwege, was einen steuerbaren Rahmen zur Steigerung der therapeutischen Wirksamkeit bei potenzieller Reduzierung systemischer Toxizitäten bietet. Das dritte Projekt konzentriert sich auf T-Zellen, die nach Tumorkontakt Interleukine sekretieren (TRUCKs). Diese nutzen einen aktivierungsabhängigen Promotor (NFAT6-IL2p), um eine präzise Zytokinsekretion nach Antigenerkennung zu steuern. Rational erstellte bizistronischer lentivirale Genlayouts zur Expression von CAR und Zytokin wurde gescreent, um die Hintergrundaktivität zu minimieren und die Induzierbarkeit zu maximieren. Während bidirektionale Konstrukte ebenfalls untersucht wurden, erwiesen sich monodirektionale Konstrukte als am wirksamsten für die Sekretion von IL12- und IL18. Insbesondere der IL18-Signalweg erwies sich bei der Nutzung dieser Logikgatter als hocheffektiv. Zur weiteren Reduzierung der systemischen Zytokinbelastung wurde eine membranverankerte und „Decoy“-resistente IL18-Variante konzipiert und charakterisiert, die eine Resistenz gegen das natürliche Inhibitorprotein IL18BP aufweist. Die vergleichende Analyse aller Projekte ergab, dass die IL12- und IL18-Signalwege besonders potent bei der Verstärkung der CAR-T-Zell-Zytotoxizität in soliden Tumormodellen sind. Bemerkenswerterweise wurde eine bessere Tumorwachstumskontrolle häufig durch CAR-T-Zellpopulationen vermittelt, die eine hohe Expression inhibitorischer Oberflächenproteine (z. B. PD1, Lag3, Tim3) aufwiesen, was klassische Marker der T-Zell-Erschöpfung („Exhaustion“) infrage stellt. Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeiten beschreiben wie neue Zelltherapien genutzt werden können um das Immunsystem auf neue Weisen zu studieren und legen offen wie Zytokine für die Therapie solider Tumor mit CAR-T Zellen kombiniert werden können.

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Keywords: CAR-T, Immunotherapy, Cytokines
• Subjects: 500 Natural sciences and mathematics; 500 Natural sciences and mathematics > 540 Chemistry and allied sciences
• Faculties: Faculty of Chemistry and Pharmacy
• Language: English
• Date of oral examination: 8. May 2026
• 1. Referee: Klein, Christian
• Signature of the printed copy: 0001/UMC 32076