Proteome analysis of human neutrophil granulocytes from patients with monogenic disease

Hesse, Sebastian (2025): Proteome analysis of human neutrophil granulocytes from patients with monogenic disease. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine

Abstract

Neutrophil granulocytes are the most abundant white blood cells in humans and play a central role in innate immunity. Monogenic mutations affecting neutrophils cause severe diseases including chronic granulomatous disease (CGD), leukocyte adhesion deficiency (LAD), and severe congenital neutropenia (SCN). Despite advances in whole-exome sequencing, 30–50% of SCN cases remain genetically unresolved, underscoring the need for complementary diagnostic approaches. This cumulative dissertation comprises two publications that investigate whether mass-spectrometry-based whole-cell proteome analysis of neutrophil granulocytes contributes to the diagnosis and pathomechanistic understanding of monogenic neutrophil disorders. Neutrophils were isolated from patients with genetically defined diseases and healthy donors using a negative-selection protocol optimized for reproducibility and transportability to international immunodeficiency centers. Proteome profiling was performed using data-independent acquisition (DIA) tandem mass spectrometry. The first publication demonstrated that neutrophils from patients with CGD, LAD, and ELANE-mutated SCN each exhibit disease-entity-specific proteome aberrations — termed disease-specific proteotypes. Mutated gene products were consistently diminished in patient cells. Importantly, in two patients with unresolved whole-exome sequencing, proteome-guided analysis identified the causative mutations in NCF1 and RAB27A, establishing proteomics as a tool to direct targeted genetic diagnostics. The second publication expanded this approach to patients with novel mutations in the signal recognition particle subunits SRP19 and SRPRA, alongside the previously described SRP54 and the common SCN genotypes ELANE and HAX1. Principal component analysis and clustering revealed genotype-specific proteome configurations, with SRP-subunit mutations forming a distinct cluster characterized by pronounced loss of primary granule proteins. Functional validation in HeLa cell models and granulopoiesis studies in iPSC-derived neutrophils and zebrafish confirmed that both novel mutations cause SCN through SRP dysfunction. This work introduced the concept of genotype-specific proteotypes and proteotypic mimicry, whereby mutations affecting the same protein complex produce overlapping proteome signatures. Together, these findings establish neutrophil whole-cell proteomics as a valuable complement to genetic diagnostics in monogenic neutrophil disorders and open new avenues for exploring genetically unresolved cases of severe congenital neutropenia.

Abstract

Neutrophile Granulozyten sind die häufigsten weißen Blutzellen des Menschen und spielen eine zentrale Rolle in der angeborenen Immunabwehr. Monogene Mutationen, die Neutrophile betreffen, verursachen schwerwiegende Erkrankungen wie die chronische Granulomatose (CGD), den Leukozytenadhäsionsdefekt (LAD) und die schwere kongenitale Neutropenie (SCN). Trotz der Fortschritte in der Ganzexomsequenzierung bleiben 30–50 % der SCN-Fälle genetisch ungeklärt, was den Bedarf an komplementären diagnostischen Ansätzen unterstreicht. Die vorliegende kumulative Dissertation umfasst zwei Publikationen, die untersuchen, ob massenspektrometriebasierte Ganzzellproteomanalysen neutrophiler Granulozyten zur Diagnostik und zum pathomechanistischen Verständnis monogener Neutrophilenerkrankungen beitragen können. Neutrophile wurden mittels eines Negativselektionsprotokolls isoliert, das für Reproduzierbarkeit und Transportfähigkeit zu internationalen Immundefizienzzentren optimiert wurde. Die Proteomprofilierung erfolgte mittels datenunabhängiger Akquisition (DIA) in der Tandem-Massenspektrometrie. Die erste Publikation zeigte, dass Neutrophile von Patienten mit CGD, LAD und ELANE-mutierter SCN jeweils krankheitsspezifische Proteomveränderungen aufweisen — sogenannte krankheitsspezifische Proteotypen. Mutierte Genprodukte waren in Patientenzellen konsistent vermindert. Bei zwei Patienten mit ungeklärter Ganzexomsequenzierung konnte die proteomgeleitete Analyse die ursächlichen Mutationen in NCF1 und RAB27A identifizieren, was die Proteomik als Werkzeug zur gezielten genetischen Diagnostik etablierte. Die zweite Publikation erweiterte diesen Ansatz auf Patienten mit neuartigen Mutationen in den Untereinheiten des Signalerkennungspartikels SRP19 und SRPRA sowie den bereits beschriebenen SRP54- und den häufigen SCN-Genotypen ELANE und HAX1. Hauptkomponentenanalyse und Clusterverfahren zeigten genotypspezifische Proteomkonfigurationen, wobei SRP-Untereinheitenmutationen ein eigenständiges Cluster mit ausgeprägtem Verlust primärer Granulaproteine bildeten. Funktionelle Validierungen in HeLa-Zellmodellen sowie Granulopoiese-Studien in iPSC-abgeleiteten Neutrophilen und im Zebrafischmodell bestätigten, dass beide neuartigen Mutationen über eine SRP-Dysfunktion SCN verursachen. Diese Arbeit führte die Konzepte der genotypspezifischen Proteotypen und der proteotypischen Mimikry ein, wonach Mutationen, die denselben Proteinkomplex betreffen, überlappende Proteomsignaturen erzeugen. Zusammengenommen etablieren diese Ergebnisse die Ganzzellproteomik neutrophiler Granulozyten als wertvolle Ergänzung zur genetischen Diagnostik monogener Neutrophilenerkrankungen und eröffnen neue Möglichkeiten zur Untersuchung genetisch ungeklärter Fälle schwerer kongenitaler Neutropenie.

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Subjects: 600 Technology, Medicine; 600 Technology, Medicine > 610 Medical sciences and medicine
• Faculties: Faculty of Medicine
• Language: English
• Date of oral examination: 12. May 2025
• 1. Referee: Klein, Christoph
• Signature of the printed copy: 0700/UMD 22712