Evolutionary engineering of Synechocystis sp. PCC 6803 towards fluctuating-light stress tolerance

Figueroa Gonzalez, Theo (2024): Evolutionary engineering of Synechocystis sp. PCC 6803 towards fluctuating-light stress tolerance. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology

Abstract

Fluctuations in irradiance are common in aquatic environments due to shading (e.g., cloud formation) and focusing of light (e.g., wave lensing effect), often exceeding those in terrestrial environments. These phenomena pose a challenge to photosynthetic organisms such as cyanobacteria, on the one hand by disrupting light-dependent regulatory processes, and on the other hand by photooxidative damage due to the absorption of excess light energy, both of which can not only negatively affect biomass productivity in a biotechnological context, but can also be lethal for the cell. Cyanobacteria such as Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) have evolved mechanisms to cope with this, including alternative electron transport mediated by flavodiiron proteins and respiratory terminal oxidases (RTOs). Recent research exploring the mechanisms of fluctuating light (FL) tolerance has focused on classical genetic approaches, where growth defects in Synechocystis KO mutants under FL regimes were evident. On the other hand, the potential of these mechanisms to enhance FL tolerance in Synechocystis remains unexplored. For instance, high-light (HL) tolerant point mutants characterized in previous studies (HL1, HL2, HL1/2, HL3, HL4, and HL5) are unable to survive under harsh FL conditions, suggesting that mechanisms of HL tolerance do not necessarily translate into FL tolerance. In this study, adaptive laboratory evolution (ALE) was employed to enhance FL stress tolerance in a glucose-tolerant, non-motile laboratory strain of the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis LT). Cultures of Synechocystis LT were subjected to incremental FL stress that increased both pulse amplitude and relative pulse duration (i.e., to a full cycle) to promote the selection of beneficial alleles according to natural selection. Analysis of whole genome sequencing data from adapted monoclonal mutants allowed the selection of three candidate non-synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs): Sll0518A133V (FL1), PAM68S113G (FL2), and RpaBT183P (FL3), which were reconstructed in the Synechocystis LT background for functional validation. FL1 and FL2 outperformed the parental strain at high pulse amplitudes (1200 → 12 µmol photons m-2 s-1) at low relative pulse duration (1 min → 5 min), demonstrating the importance of these genes in FL tolerance. FL3 was able to survive lethal FL stress at high amplitudes (1200 → 12 µmol photons m-2 s-1) at high relative pulse duration (1 min → 1 min), presumably due to the downregulation of light harvesting. In addition, growth under HL conditions was improved in all strains, suggesting that HL tolerance does not necessarily translate to FL tolerance. Furthermore, the mutations identified in FL-ALE were compared with those found in a previous study that improved high-light tolerance (HL-ALE) in Synechocystis LT. The resulting intersection revealed that the uncharacterized slr0503 gene, found exclusively in photosynthetic organisms as part of the Ycf66 protein family, accumulated multiple low-frequency non-synonymous SNPs between residues #166 and #190 in HL- and FL-ALE. The allele Ycf66-likeS178A was selected for further study and reconstructed in the LT background, yielding the HFL1 mutants. Functional validation showed that HFL1 mutants harboring a second-site mutation in another uncharacterized gene (Slr0654M75fs) were able to outperform LT under control- and high-light conditions and survive under lethal FL stress. This implies epistasis between slr0503 and slr0654 and highlights their importance for trade-off-free light-induced stress tolerance in Synechocystis. Moreover, analysis of a comprehensive set of in vitro and physiological measurements suggests an oxidized PQ pool, presumably due to increased RTO activity, protected PSII from excessive photodamage, granting HFL1 tolerance to both HL and FL stress.

Abstract

Fluktuierende Lichtintensitäten (FL) sind in aquatischen Umgebungen häufig aufgrund von Abschattungen (e.g., Wolkenbildung), und Fokussierung des Lichts (e.g., Wellenlinseneffekt). Diese Fluktuationen überschreiten oft die Werte in terrestrischen Umgebungen und stellen für photosynthetische Organismen wie Cyanobakterien eine Herausforderung dar. Einerseits behindern sie lichtabhängige Regulationsprozesse und andererseits verursachen sie photooxidative Schäden aufgrund der Absorption überschüssiger Lichtenergie. Diese Schäden können sich nicht nur negativ auf die Produktivität der Biomasse in einem biotechnologischen Kontext auswirken, sondern auch tödlich für die Zelle sein. Cyanobakterien wie Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) haben Mechanismen entwickelt, um mit FL umzugehen. Dazu gehört der alternative Elektronentransport, der durch Flavodiiron-Proteine und respiratorische terminale Oxidasen (RTOs) vermittelt wird. Forschung der Mechanismen der Toleranz gegenüber FL konzentrierten sich bisher auf klassische genetische Ansätze. Dabei waren Wachstumsdefekte in Synechocystis KO-Mutanten unter FL-Regimen offensichtlich. Das Potenzial dieser Mechanismen zur Verbesserung der FL-Toleranz in Synechocystis ist jedoch noch unerforscht. Die Starklicht- (HL) toleranten Punktmutanten HL1, HL2, HL1/2, HL3, HL4 und HL5 sind unter letalen FL-Bedingungen nicht überlebensfähig. Dies deutet darauf hin, dass Mechanismen der HL-Toleranz nicht zwangsläufig FL-Toleranz vermitteln. In dieser Studie wurde adaptive Laborevolution (ALE) eingesetzt, um die FL-Stresstoleranz (FL-ALE) in einem glukosetoleranten, unbeweglichen Laborstamm des Modell-Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis LT) zu verbessern. Synechocystis LT-Kulturen wurden einer inkrementellen FL-Belastung unterzogen, die sowohl die Amplitude als auch den Arbeitszyklus erhöhte, um die Selektion vorteilhafter Allele durch Selektion zu fördern. Die Analyse von Ganzgenomsequenzierungsdaten von adaptierten monoklonalen Mutanten ermöglichte die Auswahl von drei nicht-synonymen Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs): Sll0518A133V (FL1), PAM68S113G (FL2), und RpaBT183P (FL3), die in dem Synechocystis LT-Hintergrund für funktionelle Validierung rekonstruiert wurden. FL1 und FL2 übertrafen den LT bei hohen Amplituden (12 → 1200 µmol Photonen m-2 s-1) und niedrigen Arbeitszyklen (1 min → 5 min), was die Bedeutung dieser Gene für die FL-Toleranz belegt. FL3 überlebte letalen FL-Stress bei hohen Amplituden (12 → 1200 µmol Photonen m-2 s-1) und hohen Arbeitszyklen (1 min → 1 min), vermutlich aufgrund der Herunterregulierung der Lichtausbeute. Außerdem verbesserte sich das Wachstum unter HL-Bedingungen bei allen Stämmen, was zeigt, dass HL-Toleranz nicht unbedingt auf FL-Toleranz übertragbar ist. Darüber hinaus wurden die in FL-ALE identifizierten Mutationen mit denen verglichen, die in einer früheren Studie zur Verbesserung der HL-toleranz (HL-ALE) in Synechocystis LT gefunden wurden. Die Schnittmenge ergab, dass das bisher nicht charakterisierte Gen slr0503, das ausschließlich in photosynthetischen Organismen als Teil der Ycf66-Proteinfamilie vorkommt, in beiden Experimenten mehrere nichtsynonyme SNPs mit niedriger Frequenz zwischen den Aminosäuren #166 und #190 aufweist. Das Allel Ycf66-likeS178A wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt und im LT-Hintergrund rekonstruiert (HFL1). Die funktionelle Validierung zeigt, dass HFL1-Mutanten, welche eine Mutation an einer zweiten Stelle in einem anderen nicht charakterisierten Gen (Slr0654M75fs) aufweisen, unter Kontroll- und HL-bedingungen in der Lage waren, den Elternstamm zu übertreffen und unter letalen FL-Bedingungen zu überleben. Dies deutet auf eine epistatische Wechselwirkung zwischen slr0503 und slr0654 hin und unterstreicht deren Bedeutung für eine lichtinduzierte Stresstoleranz ohne Nachteile in Synechocystis. Darüber hinaus deutet die Analyse einer umfassenden Reihe von in vitro und physiologischen Messungen darauf hin, dass ein oxidierter PQ-Pool, der vermutlich auf eine erhöhte RTO-Aktivität zurückzuführen ist, PSII vor übermäßiger Lichtschäden schützt und HFL1 Toleranz sowohl gegenüber HL- als auch FL-Stress verleiht.

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Subjects: 500 Natural sciences and mathematics; 500 Natural sciences and mathematics > 570 Life sciences
• Faculties: Faculty of Biology
• Language: English
• Date of oral examination: 24. June 2024
• 1. Referee: Leister, Dario
• Signature of the printed copy: 0001/UMC 32050