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Burgard, Caroline (2017): Die Biogenese der mitochondrialen Superoxid-Dismutase 1. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Das Enzym Superoxid-Dismutase1 (Sod1) katalysiert die Umwandlung von Superoxid-Anionen und schützt die Zelle vor oxidativem Stress. Das Enzym wird durch sein Kupfer-Chaperon (Ccs1) aktiviert, welches für den Einbau des Kupfer-Ions und einer Disulfidbrücke sorgt. In vielen Organismen gibt es neben dem Ccs1-abhängigen Aktivierungsweg auch noch einen Ccs1-unabhängigen Aktivierungsweg. Sod1 liegt in der Zelle überwiegend im Zytosol vor, aber zu einem geringen Anteil auch in Mitochondrien. Bei 20% der Fälle der erblich bedingten Amyotrophen Lateralsklerose (fALS) sind Mutationen des SOD1-Gens beteiligt (Boillee et al., 2006). Da Dysfunktionen der Mitochondrien in diesen Fällen beobachtet worden sind (Deng et al., 2006, Ferri et al., 2006), könnte es bedeuten, dass die mitochondriale Form der Sod1 und ihre Biogenese möglicherweise eine Rolle für den Pathomechanismus der fALS spielen. Deshalb ist es wichtig, den Mechanismus der Biogenese von mitochondrialer Sod1 (mtSod1) zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die Ccs1-unabhängige und die Ccs1-abhängige Biogenese von mtSod1 im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Sod1 in Abwesenheit von Ccs1 (Δccs1-Zellen) im Intermembranraum (IMR) von Mitochondrien lokalisiert ist, wenn auch in deutlich geringeren Mengen als in Wildtyp-Mitochondrien. Für den Import von Sod1 in Abwesenheit von Ccs1 spielt das Mia40/Erv1-Disulfid-Transfer-System eine wichtige Rolle. Die Depletion von Mia40 führt zur Reduktion der Menge an mtSod1 und die Überexpression von Mia40 zu erhöhten Mengen an mtSod1. Der Redoxzustand von mtSod1 ist auch von Ccs1 abhängig. In Abwesenheit von Ccs1 liegt mtSod1 in reduzierter und oxidierter Form vor, während es in Anwesenheit von Ccs1 vollständig oxidiert ist. Mittels Aktivitätstest konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, dass Sod1 in Mitochondrien von Hefe-ccs1-Zellen nicht aktiv ist. Erhöhte Mengen an Mia40 führen nicht zur Aktivierung von Sod1 in Mitochondrien von ccs1-Zellen. Ccs1 wird in Hefe also zur Aktivierung von mtSod1 benötigt. Es stellte sich die Frage, welche der Cystein-Reste in Ccs1 dafür notwendig sind. Dazu wurden Cystein-zu-Serin-Varianten von Ccs1 exprimiert. In der C229/231S-Ccs1 Mutante wurde keine Sod1-Aktivität in Mitochondrien detektiert, was die mit Zellextrakten erhaltenen Ergebnisse von Lamb et al., 2001 stützt. Die C17/20S-Ccs1 Mutante hat eine dem Wildtyp vergleichbare Sod1-Aktivität in Mitochondrien. Demgegenüber besitzt die C27/64S-Ccs1 Mutante eine deutlich reduzierte mitochondriale Sod1-Aktivität. Zusätzliche Untersuchungen ergaben, dass dies auf einer verringerten Proteinmenge an Sod1 in Mitochondrien der C27/64S-Ccs1 Mutante beruht. Der Import von Ccs1 in Mitochondrien ist von den Cystein-Resten C27 und C64 abhängig. Sod1 wird großteils mit Hilfe von Ccs1 in Mitochondrien importiert, so dass reduzierte mitochondriale Mengen an Ccs1 wiederum zu verringerten Sod1-Mengen in Mitochondrien führen. Die spezifische Aktivität pro Molekül Sod1 ist in der C27/64S-Ccs1 Mutante nicht betroffen. In Zellextrakten, in denen in der C27/64S-Ccs1 Mutante gleiche Mengen an Sod1 wie in Wildtyp-Zellen vorliegen, sind die Aktivitäten vergleichbar hoch. Entsprechendes gilt für die Sod1-Aktivitäten, wenn die C27/64S-Ccs1 Variante und WT-Ccs1 mittels der Präsequenz des Cytochrom b2 in den IMR importiert wurden und somit in gleich hohen Mengen im IMR vorlagen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Cystein-Reste C27 und C64 des Ccs1 für die Aktivierung von mtSod1 nicht nötig sind. Um den mitochondrialen Biogeneseweg von humaner Sod1 (hSOD1) zu charakterisieren, wurde hSOD1 in S. cerevisiae exprimiert. hSOD1 wurde sowohl in Wildtyp-, als auch in ccs1-Zellen im IMR von Mitochondrien detektiert. Es zeigte sich, dass der Transport in Mitochondrien unabhängig von Mia40 erfolgt und damit von dem der Hefe-Sod1 verschieden ist. In dieser Arbeit wurden wertvolle Erkenntnisse zur Ccs1-abhängigen und Ccs1-unabhängigen Biogenese von mtSod1 erhalten. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen worden, um die mitochondriale Biogenese von in fALS vorkommenden Sod1-Mutanten zu untersuchen und den Pathomechanismus der Sod1-abhängigen fALS besser zu verstehen.