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Tucakov, Anna Katharina (2016): Gezielte Attenuierung und Markierung von Pestiviren: Charakterisierung eines Virulenzmarkers & Kartierung eines hochkonservierten Epitops. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

BVDV und CSFV zählen zum Genus Pestivirus, das ausschließlich tierpathogene Erreger beinhaltet. Diese Pathogene verursachen in landwirtschaftlichen Nutztieren Infektionskrankheiten, die zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führen. Um diese Schäden besser eindämmen und die Krankheiten erfolgreich bekämpfen zu können, ist es erforderlich moderne, verbesserte Vakzinen zu entwickeln. Um eine Basis für solche neuen Vakzinestrategien zu schaffen, wurde viel in die Forschung investiert, um die Molekularbiologie der Pestiviren aufzuklären. Wichtige Ziele dieser Forschung sind ein verbessertes Verständnis der Funktionsweisen essentieller, viraler Proteine und die Identifizierung hochkonservierter Epitope als Ausgangspunkt zur Entwicklung sicherer und effizienter Markerimpfstoffe. Der Dimerisierung des Erns wurde bereits eine Funktion als Virulenzfaktor der Pestiviren zugeschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Relevanz der Erns-Dimere für die Virulenz von CSFV durch Analyse einer Pseudorevertante mit restaurierter Fähigkeit zur Dimerisierung näher zu untersuchen. Aufbauend auf Ergebnissen vorangegangener Arbeiten wurden Pathogenitätsstudien im natürlichen Wirt durchgeführt. In diesen wurde die Pathogenese ausgelöst durch die Pseudorevertante (C171S/S209C), die über das Cystein an Position 209 anstelle des ursprünglichen Cysteins 171 kovalent verbundenen Dimere bilden kann, mit der parentalen attenuierten, dimerisierungsnegativen CSFV-Mutante (C171S) und dem Wildtypvirus CSFV Alfort/Tübingen verglichen und charakterisiert. Die Experimente bestätigten die Ergebnisse der vorangegangenen Studien und zeigten, dass die Attenuierung des dimerisierungsnegativen Virus (C171S) durch Pseudoreversion (C171S/S209C) partiell aufgehoben werden kann. Somit konnte der Zusammenhang zwischen der Virulenz des CSFV und der Erns-Dimerbildung auch positiv belegt werden. Das Wissen um hoch immunogene Regionen und definierte Epitope der Antikörper-induzierenden Proteine von Viren könnte zur Entwicklung von DIVA-Strategien für Impfstoffe genutzt werden. Zu diesem Zweck wurde die Lokalisation des hochkonservierten Epitops, das vom panpesti mAk Code4 erkannt wird, im Nichtstrukturprotein NS3 kartiert. Die Antikörperbindungsstelle konnte auf den Bereich 364HPIEEFIAPE373[…]380LGSQFLDIAGLKIP393 eingrenzt werden. Zur Überprüfung, ob eine Veränderung dieser Region des für die Replikation essentiellen Proteins vom Virus toleriert wird, wurde eine Code4-negative BVD-Virusmutante mit der Mutation PE372-373AA etabliert. Die Virusmutante erwies sich in Passagen als stabil und zeigte keine deutliche Einschränkung der Replikationsfähigkeit. Das von diesem Virus exprimierte NS3-Potein wurde vom mAk Code4 nicht erkannt. Veränderungen an diesem Epitop könnten somit Anwendung als Negativmarkierung im Sinne des DIVA-Konzeptes finden.

Abstract

BVDV and CSFV belong to genus Pestivirus, a group of pathogens comprising solely animal viruses. These viruses induce infectious diseases of livestock, which lead to enormous economic losses. To counteract to these losses and fight the diseases, improved modern vaccines have to be developed. In order to provide a basis for novel vaccine approaches, a lot of research was done to come to a better understanding of the molecular biology of pestiviruses. Important aims of this work were to gain detailed knowledge of functional principles of essential proteins as well as to identify highly conserved epitopes as starting point for the development of modern, safe and efficient marker vaccines. A function as virulence determinant was already proposed for the dimerization of the structural protein Erns. The objective of the present work was to confirm the impact of Erns dimers for CSFV virulence through analysis of pseudorevertants with restored ability to form Erns dimers. Based on the results of previous experiments two studies were conducted to define the pathogenicity of such pseudorevertants in the natural host. The clinical outcome of a pseudorevertant virus (C171S/S209C), a mutant in which the formation of covalently linked homodimers was reestablished through the Cysteine at position 209 instead of the original Cysteine 171, was compared to the parental attenuated, dimerization negative virus (C171S) and the wild type virus. The studies confirmed the results of the former experiments and indicated that the attenuation of the dimer-negative virus can be partially abolished through the observed pseudoreversion. Thus, the direct link between CSFV virulence and Erns dimer formation could be proven. The knowledge of highly immunogenic regions as well as defined epitopes of immunodominant proteins can be used to develop DIVA strategies for viral vaccines. Therefore, the aim of the second part of this thesis was to map the localization of a highly conserved epitope of the non-structural protein NS3 recognized by the panpesti mAb Code4. The binding region could be narrowed down to aa 364HPIEEFIAPE373[…]380LGSQFLDIAGLKIP393. To validate if a mutation of the essential protein could be tolerated by the virus, a Code4 negative BVD mutant was established by introducing the mutation PE372-373AA. This exchange was found to be stable during passages of the recovered virus, which did also not show significant impairment of its replication efficiency. The NS3 protein expressed by the mutant was not detected by the mAb Code4, providing proof of principle that a negative marker DIVA concept could be implemented based on changes affecting the mapped epitope.

Abstract

Englische Übersetzung des Titels: Targeted attenuation and marking of Pestiviruses: characterization of a virulence marker & mapping of a highly conserved epitope