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Walker, Andreas (2016): Differentielle Proteomanalyse in einem Modell der Epileptogenese: Regulation inflammations-assoziierter Proteine. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Bei Hund und Katze sowie beim Menschen zählen Epilepsien zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine vollständige Prävention der Epilepsieentstehung (Epileptogenese) haben sich bis heute alle therapeutischen Strategien als klinisch unwirksam erwiesen. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Epileptogenese zugrunde liegen, stellt die Grundvoraussetzung für die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern dar. Differentielle Proteomanalysen könnten wesentlich dazu beitragen die komplexen epileptogenese-assoziierten molekularen Veränderungen zu erforschen. Daher wurde in der vorliegenden Dissertationsstudie eine differentielle Proteomanalyse in einem Tiermodell der Epileptogenese durchgeführt. Die Induktion der Epileptogenese erfolgte in einem elektrischen Post-Status-Epilepticus-(SE)-Modell bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten. Hippocampales (HC) und parahippocampales (PHC) Gehirngewebe von SE- und Kontrolltieren wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen nach SE) entnommen und mittels markierungsfreier Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Zeitpunkte reflektieren die Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase mit spontanen wiederkehrenden Anfällen. Unter Berücksichtigung der besonderen Rolle inflammatorischer Signalwege im Kontext der Epileptogenese, erfolgte neben der unspezifischen Datenanalyse eine fokussierte Auswertung immun- und inflammations-assoziierter Prozesse. Die anschließende immunhistochemische Untersuchung der Gewebe diente sowohl der Validierung der Methodik, als auch der Validierung des differentiellen Expressionsmusters ausgewählter Proteine. Durch die Studie konnte gezeigt werden, dass zu allen untersuchten Zeitpunkten im PHC mehr Proteine reguliert waren als im HC. Des Weiteren ließen sich in beiden Gehirnregionen die umfangreichsten molekularen Veränderungen in der Latenzphase nachweisen. Durch die Pathway-Enrichment-Analyse konnte im HC während der Post-Insult-Phase eine ausgeprägte Neurodegeneration dargestellt werden. Weiterhin zeigte sich in beiden Gehirnregionen eine Regulation Integrin-assoziierter Prozesse während der Latenzphase und der chronischen Phase. Ein signifikantes Enrichment neurodegenerativer und proliferativer Signalwege ließ sich im PHC acht Wochen nach SE darstellen. Im Hinblick auf immun- und inflammations-assoziierte Prozesse konnte eine Überrepräsentation entsprechender Pathways während der Post-Insult-Phase und der Latenzphase nachgewiesen werden. Die regulierten Pathways umfassten unter anderem Toll-like-Rezeptor-(TLR)-vermittelte Signalwege, Synthese und Regulation von Prostaglandinen, leukozytäre transendotheliale Migration und die Signaltransduktion durch transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF beta). Die inflammatorische Antwort während der chronischen Phase zeigte im PHC eine stärkere Regulation als im HC. Im Rahmen der immunhistochemischen Validierung konnte das differentielle Expressionsmuster der Proteine Heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y Purinoceptor 12 (P2ry12) und P2X Purinoceptor 7 (P2rx7) bestätigt werden, die eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Mikroglia spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Veränderungen der Epileptogenese. Darüber hinaus deuten sie auf eine unterschiedliche Veränderung der molekularen Muster von HC und PHC während dem Zeitverlauf der Epileptogenese hin. Die Daten stellen zudem neue Informationen über das differentielle Expressionsmuster zahlreicher Proteine zur Verfügung, die bei wichtigen inflammatorischen Prozessen und Signalwegen eine Rolle spielen. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Regulation TLR-assoziierter Proteine und Purinozeptoren, die zu den essentiellen Modulatoren der inflammatorischen Antwort gezählt werden. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zu unserem Verständnis über die molekularen und im Besonderen die inflammatorischen Mechanismen der Epileptogenese bei. Die Ergebnisse liefern eine umfassende Grundlage für die zukünftige Identifikation und Entwicklung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern für molekulare Bildgebungsverfahren. Die funktionellen Einflüsse einzelner Proteine sollten in zukünftigen Studien (zum Beispiel in Knock-out-Maus-Modellen) bestätigt und genauer untersucht werden.

Abstract

Epilepsies are one of the most common chronic neurologic disorders in dogs and cats as well as in humans. Regarding the prevention of the development of epilepsy (epileptogenesis), to date all therapeutic strategies have proved to be clinically ineffective. A better understanding of the basic mechanisms of epileptogenesis is a presupposition for the identification of therapeutic targets and biomarkers. Differential proteome analysis can provide substantial information about the molecular alterations during epileptogenesis. Thus, a differential proteome analysis was performed in an animal model of epileptogenesis. For this purpose, an electrical post-status epilepticus-(SE)-model was used to induce epileptogenesis in female Sprague Dawley rats. Hippocampal (HC) and parahippocampal cortex (PHC) tissue were collected from SE- and control animals at three different time points (two days, ten days and eight weeks after SE). Samples were subjected to label-free liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The time points reflect the early post-insult phase, the latency phase and the chronic phase with spontaneous recurrent seizures. Considering the key role of inflammatory signalling during epileptogenesis, data analysis focused on processes linked with immune and inflammatory responses. Subsequently immunohistochemistry was performed for the validation of the methodology and selected proteins of interest. The study indicates, that in the PHC more proteins were regulated than in the HC at all three time points. Furthermore the most comprehensive molecular alterations were identified during the latency phase in both brain regions. Pathway enrichment analysis revealed a pronounced neurodegeneration in the HC during the early post-insult phase. In addition, both brain regions showed a regulation of integrin-associated processes during the latency phase and during the chronic phase. Eight weeks post-SE, a significant enrichment of neurodegenerative and proliferative signalling was identified in the PHC. With regard to processes linked with immune and inflammatory responses pathway enrichment analysis revealed an overrepresentation of respective pathways during the post-insult phase and during the latency phase. Among others, these pathways comprised pathways associated with Toll-like receptor-(TLR)-signalling, prostaglandin synthesis and regulation, leukocyte transendothelial migration and signalling of cytokine transforming growth factor beta (TGF beta). During the chronic phase inflammatory signalling in the PHC exceeded that in the HC. Immunohistochemistry confirmed differential expression of the proteins heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y purinoceptor 12 (P2ry12) and P2X purinoceptor 7 (P2rx7) which play a major role in the activation of microglia. In summary, the data provide novel information about the complex molecular alterations during epileptogenesis. The results point to different alterations of molecular patterns of hippocampal and parahippocampal cortex tissue during the time course of epileptogenesis. Moreover, novel information about the differential expression of numerous proteins was shown, which play an important role in major inflammatory signalling events. In this context the regulation of TLR-associated proteins and purinoceptors is of particular importance, since these proteins are crucial modulators of the inflammatory response. The study contributes significantly to our current understanding of the molecular, and in particular the inflammatory mechanisms during epileptogenesis. The data sets provide a comprehensive basis for the future identification and development of therapeutic targets and of biomarkers for molecular imaging. The functional impact of individual proteins has to be confirmed in follow-up studies, for instance in knockout mouse models.