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Loser, Michael (2015): Eine zelluläre und molekulare Charakterisierung der Gliazellen des Zentralkomplexes im embryonalen Gehirn von Schistocerca gregaria. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase in Ergänzung zum gliaspezifischen Marker Repo, um Gliazellen, die mit der embryonalen Entwicklung des Zentralkomplexes in Schistocerca gregaria assoziiert sind, zellulär und molekular zu charakterisieren. Der Zentralkomplex ist ein modulares System neuropiler Strukturen im Mittelhirn aller Insekten, und ist in vielen Verhaltensvorgängen wie Laufen, Fliegen, Stridulation und Ernährung involviert. In der Heuschrecke entwickeln sich die Neuropile des Zentralkomplexes im Laufe der Embryogenese und sind zum Zeitpunkt des Schlüpfens funktionsfähig. Trotz großer Kenntnisse neuronaler Aspekte über die Entwicklung des Zentralkomplexes verbleibt die Funktion der Gliazellen unklar. In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase (GS) und des gliaspezifischen Homöobox Gens reversed polarity (repo) in Kombination mit der negativen Expression des neuron-spezifischen Markers Meerrettich Peroxidase (HRP) zur Identifizierung glialer Zellen benutzt. Doppelfärbungen zeigen, dass alle GS-positiven Zellen, die mit dem Zentralkomplex assoziiert sind, gleichzeitig Repo-positiv sind. Zum ersten Mal konnte ich durch diese Kombination nicht nur Zellkörper, sondern auch Projektionen (Gliapodien) der Gliazellen sichtbar machen. Während der Embryogenese, also noch vor der Entwicklung des Zentralkomplexes, formen Gliazellen eine zusammenhängende Population, die aus der Pars intercerebralis in die Region der Faserbündel einwandert. Anschließend verteilen sich die Gliazellen neu und umhüllen jedes der einzelnen Module des Zentralkomplexes. Innerhalb der einzelnen Neuropile des Zentralkomplexes sind keine glialen Zellkörper zu finden. Rekonstruktionen einzelner Zellen zeigen Populationen von Gliazellen, die ausgedehnte umhüllende Projektionen um die Neuropile des Zentralkomplexes, wie den Zentralkörper, senden, während eine andere Population von Gliazellen säulenartige Verzweigungen in den Zentralkörper hinein projiziert. Solche Verzweigungen in den Modulen des Zentralkomplexes sind erst nach Fertigstellung der Neuroarchitektur zu erkennen. Daher kann man annehmen, dass diese Verzweigungen auf ein zuvor entstandenes Gerüst von Neuronen oder Tracheen projizieren. Höchstwahrscheinlich sind diese Gliaprojektionen in die Transmitterregulation innerhalb des Neuropils involviert. Da Gliazellen weitreichende Projektionen (Gliapodien) in und um die Mittelhirnneuropile senden, wurden in gefrorenen Hirnschnitten intrazelluläre Injektionen durchgeführt um zu erforschen, ob diese Gliazellen ein zelluläres Netzwerk via Zellkopplung im Verlauf der Embryogenese bilden. Färbungen individueller Zellen, die an vier unterschiedlichen Injektionsstellen um den Zentralkörper lokalisiert sind, zeigen eine Population gekoppelter Zellen, deren Anzahl und räumliche Verteilung stereotypisch für jeden der Injektionspunkte ist. Darüber hinaus sind sie sowohl bei 70%igem wie auch bei einem embryonalen Entwicklungsstand von 100% miteinander vergleichbar. Anschließende immunhistochemische Experimente bestätigen, dass es sich bei den gekoppelten Zellen um astrozytenähnliche Gliazellen handelt. Durch Hinzufügen von n-Heptanol in das Puffermedium wurde die Zellkopplung verhindert. Da die Zellkopplung auch ohne direkten intersomalen Kontakt auftritt, könnten die erheblichen Verzweigungen der Gliapodien, die sich im Laufe der Embryogenese ausbreiten, involviert sein. Durch die Datenerhebung aller Injektionspunkte kann darauf geschlossen werden, dass die Gliazellen, welche den Zentralkörper umrunden, ein Netzwerk gekoppelter Gliazellen bilden, das als Positionierungssystem der sich entwickelnden Neuropile des Zentralkomplexes dient.

Abstract

This thesis employs cellular and molecular methods to characterize glia associated with the central complex of the brain during embryonic development of the grasshopper Schistocerca gregaria. The central complex is a modular system of neuropils in the midbrain of all insects, and is involved in regulating a range of behaviors such as walking, flight, stridulation and feeding. In the grasshopper, these neuropils develop during embryogenesis and are functional at the time of hatching. Despite considerable knowledge about neuronal aspects of central complex development, the role of glia remains obscure. I have used the expression patterns of the astrocyte-specific enzyme glutamine synthetase (GS) and the glia-specific homeobox gene reversed polarity (repo), in combination with the negative expression of the neuron-specific cell surface marker horseradish peroxidase (HRP), to identify glia in the embryonic brain of the grasshopper. Together, the cytoplasmic GS-expression, and the nuclear repo-expression allow not only the cell somata, but also their projections (gliopodia) to be visualized during development for the first time. Early in development, prior to formation of the central complex, glia are distributed in a non-specific way in the pars intercerebralis of the midbrain. Subsequently, glia are seen to migrate into the developing commissural system of the midbrain and then redistribute again to surround the central complex neuropils as they form. Reconstructions of individual glia cells associated with the central complex show that some glia generate extensive projections which envelop the neuropil. Others direct projections into the neuropil where they arborize extensively among the fiber columns formed by the axons of neurons from the pars intercerebralis. Since the glial projections only develop after those of the neurons, I speculate that glia utilize a pre-formed scaffold of axons or tracheae to innervate the central complex. It is likely that the glial projections are involved in transmitter regulation at synaptic sites within the neuropil. In order to establish whether the glia associated with the central complex form a network of communicating cells, I performed intracellular stainings of glia in frozen slices of the midbrain at different stages of embryonic development. Cells were identified as glia by immunolabeling against GS. Once injected into an individual glia cell, the fluorochrome Alexa568 consistently and rapidly spread to a restricted set of neighboring cells. The population of dye-coupled cells was stereotypic and depended on its location (anterior, posterior, lateral) with respect to the central body module, suggesting that subsets of linked cells are present. Addition of the established gap-junctional blocker n-heptanol to the bathing saline prevented dye-coupling, consistent with the presence of gap junctions between glia. Dye-coupling was present without direct intersomal contact suggesting that the gliapodia are involved in establishing the network. The data lead me to speculate that the network of dye-coupled cells surrounding the central complex may function as a positioning system for the developing neuropils of the central complex.