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Weth, Verena (2015): Untersuchungen zur Rolle der Rezeptortyrosinkinasen FLT3, DDR1 und DDR2 in der akuten myeloischen Leukämie. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous clonal disorder. Receptor tyrosine kinases (RTKs) like FLT3 play an important role in leukemogenesis. However, constitutively activated RTKs (e.g. by mutations) alone are not sufficient to induce AML. Cooperating mutations are necessary. NPM1 mutations and FLT3 internal tandem duplications (ITD) represent the most frequent concomitant mutations in AML. Clinical data shows that a FLT3-ITD negatively modulates the favorable prognosis of NPM1 mutated (NPM1c+) patients depending on the FLT3-ITD mRNA level. This indicates a pathogenic interaction of NPM1 and FLT3-ITD mutations in AML which was analyzed in this thesis. Based on the human AML cell line OCI-AML3 the first cellular model system that models the relevant genotypes (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) and different ratios of FLT3-ITD to FLT3-WT (ITD/WT) in a NPM1 mutated background was established using stable, lentiviral transduction. The presence of the NPM1 mutation and the functionality of the FLT3-WT and FLT3-ITD receptor in native and transgenic cells had been confirmed. Cells which carried both mutations had a proliferation advantage in vitro and in vivo that accelerated with increasing ITD/WT ratio. Starting from certain ITD/WT ratio the proliferation advantage could be inhibited in vitro for a period of time using a FLT3 inhibitor. These results might indicate an interaction of both mutations in leukemogenesis and explain the poor survival curves of patients who harbor both mutations and increasing ITD/WT ratio. The overall weak phenotype of the cellular model system requires an alternate model system to clearly proof the functional interaction of NPM1 and FLT3-ITD mutations. OCI-AML3 that overexpressed the FLT3-WT receptor also showed a slight proliferation advantage compared to cells with baseline FLT3-WT expression in native cells. In addition to activating FLT3 mutations like an ITD, high FLT3-WT expression level also lead to constitutive activation of the FLT3 kinase and worsen the prognosis of the patients. Therefore the transcriptional regulation of FLT3 as a potential cause of high FLT3-WT expression level was investigated in this thesis. Binding sites for the haematopoietic transcription factors (TF) PAX5 and MYB in the proximal promoter of FLT3 were identified in silico. With the aid of the Dual-Luciferase® Reporter Assay system PAX5 was confirmed as a weak repressor and MYB as an activator of the Flt3 promoter. In addition the transcription factor CEBPA was analyzed. CEBPA activated the Flt3 promoter in a similar manner as MYB. A point mutation in the CEBPA gene which is known from two familial AML cases approximately doubled the Flt3 promoter activity compared to wild type CEBPA. The identification of more mutations in TF regulating FLT3 and their correlation with the FLT3 expression should provide insight into the transcriptional regulation of FLT3 as a potential cause of the FLT3 overexpression in AML patients. The role in the pathogenesis of AML is unknown for a number of AML related mutations e.g. mutations in the receptor tyrosine kinases DDR1 and DDR2. In this thesis DDR1 and DDR2 mutations were stably expressed in Ba/F3 cells and transiently expressed in HEK-293T cells to investigate their transforming potential and to functionally characterize them. Transgenic DDR1 and DDR2 expressing Ba/F3 cells did not reveal a transforming phenotype. The extracellular DDR2 mutations (G222R, M291I) showed a constitutive phosphorylation in HEK-293T cells and the wild type DDR1 receptor as well as the mutant DDR1 receptor expressing Ba/F3 cells adhered to their ligand collagen. So far DDR1 and DDR2 receptors have been studied in solid tumors primarily. To determine their significance in the pathogenesis of AML further functional analysis need to be performed. This thesis shows that distinct receptor tyrosine kinases can play an important role in leukemogenesis. Furthermore, receptor tyrosine kinases are of particular importance because they represent crucial target molecules for therapeutic approaches.