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Bach, Juri (2015): Molecular view on the spatiotemporal organization of Bacillus subtilis subcellular compartments. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

All living cells are highly organized and exhibit complex cellular machineries facilitating biochemical reactions. Compartmentalization is a prerequisite to allocate an appropriate environment for these processes. In this work, compartments that are involved in Bacillus subtilis membrane organization and cell division were studied. B. subtilis division site selection is dependent on the nucleoid occlusion and the Min system. The B. subtilis Min system consists of four components. MinC is the actual inhibitor of the tubulin homologue FtsZ that is a crucial component of the divisome, forming the so called Z-ring. MinC is bound to the ATPase MinD that is tethered via the adapter protein MinJ to DivIVA. DivIVA senses membrane curvature and was supposed to be stably tethered to the cell poles. Thereby a stable, static DivIVA / MinJDC gradient with minimum concentration at midcell is formed. Using advanced microscopy techniques like single cell time lapse microscopy, fluorescence recovery after photo bleaching and by utilization of photo-activatable / convertible fluorophores we could demonstrate that DivIVA is in vegetative cells recruited from the cell pole to mature septa. These data provide first evidence that the role of the B. subtilis Min system is not to define midcell, but prevents reinitiation of Z-ring constriction after fulfilled division. Utilizing single cell time lapse microscopy we could further demonstrate that proteins crucial to condense the chromosome are vital for correct chromosome segregation during cell division by influencing the replication fork velocity or resolution. As a second compartment B. subtilis flotillin dependent membrane microdomains were studied. These domains are likely scaffolded by the membrane protein flotillin. This protein is pinned to the membrane via a hairpin loop as shown by SNAP–tag labelling experiments. Utilizing the anisotropic dye Laurdan we could further show spectroscopically and microscopically that flotillins prevent condensation of microdomains. Flotillin deletion strains also exhibit a generally more liquid ordered membrane compared to wild type cells. Using co–immunoprecipitation experiments several proteins interacting with flotillin were identified. These interactions were confirmed with microscopical co–localization analysis. B. subtilis flotillin was additionally heterologously purified via affinity chromatography. The purified protein creates large homo–oligomers likely in mega Dalton size. Using truncation mutants it could be shown that flotillin oligomerizes via a flotillin specific domain, namely the PHB domain. Though, contrary to eukaryotic cells, B. subtilis PHB domain does not contribute to lipid binding. However, several cellular machineries that interact with flotillins, as exemplary shown for the secretion machinery, are impaired in their functionality in absence of flotillins. These data provide first evidence that prokaryotic flotillins are elements that scaffold the plasma membrane and thereby provide a lipid environment that is vital for correct functionality of diverse cellular machineries.

Abstract

Die räumliche und zeitliche Trennung von komplexen biologischen Prozessen durch Kompartimentalisierung bildet eine Grundlage für die Funktionalität von Zellen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Kompartimente des Bakteriums Bacillus subtilis untersucht. Insbesondere Domänen die in der Membran und während der Zellteilung von B. subtilis vorzufinden sind wurden analysiert. Die Zellmitte wird in B. subtilis durch zwei unterschiedliche Systeme definiert, das Nucleoid Okklusions System und das Min System. Das Min System besteht aus vier Komponenten. MinC ist der Inhibitor des Tubulin Homologs FtsZ, welches ein zentraler Bestandteil des Divisoms ist und den Z-Ring bildet. MinC ist gebunden an die ATPase MinD die über das Adapterprotein MinJ an DivIVA gebunden ist. DivIVA bindet an gekrümmte Membranen und es wurde vermutet, dass es stabil an den Zellpol gebunden ist wodurch ein statischer DivIVA / MinJDC Gradient mit minimaler Konzentration in der Zellmitte entsteht. Durch die Verwendung fortgeschrittener Mikroskopietechniken, insbesondere durch die Verwendung von Foto–aktivierbaren / konvertierbaren Fluorophoren, konnte hier gezeigt werden, dass in vegetativen Zellen DivIVA vom Zellpol zum Septum rekrutiert wird. Diese Daten implizieren, dass das B. subtilis Min System nicht für die Findung der Zellmitte zuständig ist, sondern eine erneute Konstriktion des Z-Ringes nach vollzogener Zellteilung verhindert. Mittels Einzelzellenzeitreihenmikrosopie konnte außerdem gezeigt werden, dass Proteine, die bei der Chromosomkondensation involviert sind, auch für die korrekte Chromosomensegregation während der Zellteilung zuständig sind, da diese Proteine einen direkten Einfluss auf die Replikationsgabel haben. Als ein weiteres Kompartiment wurden B. subtilis Membran-Mikrodomänen (Md) untersucht. Diese Md werden wahrscheinlich von dem Protein Flotillin gebildet. Flotillin bindet mittels einer Haarnadelschleife an die Membran, was mit Hilfe von SNAP–Markierungsexperimenten gezeigt wurde. Mit Hilfe des anisotropischen Farbstoffes Laurdan konnte spektroskopisch und mikroskopisch gezeigt werden, dass Flotilline ein Verschmelzen von Md verhindern. Flotilline halten somit eine Membranheterogenität aufrecht. Nach Deletion von Flotillinen war die Membran generell stärker kondensiert. Mittels Co-immunpräzipitationsexperimenten konnten zudem verschiedene Flotillin-Interaktionspartner identifiziert werden, die mikroskopisch mittels Kolokalisationsexerimenten bestätigt wurden. Die Abwesenheit von Flotillinen in vivo beeinflusst die Funktionalität verschiedener zellulärer Maschinen, was beispielhaft für das Sec-System gezeigt wurde. Des Weiteren wurde Flotillin heterolog exprimiert und gereinigt, wodurch gezeigt werden konnte, dass es große Oligomere in MDa Größe bildet. Durch die Reinigung von verkürzten Flotillin-Varianten konnte demonstriert werden, dass die Oligomerisierung über die PHB Domäne geschieht. Diese kann jedoch nicht an Lipide binden. Diese Daten implizieren das Flotilline nötig sind, um eine korrekte Lipidumgebung zu schaffen, die für die Funktionalität von verschiedenen Proteinen nötig ist.