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Limmer, Simone (2014): Zielgerichtete Chemotherapie solider Tumoren durch thermosensitive Liposomen in Kombination mit Doxorubicin, Gemcitabin und Mitomycin C. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Auf DPPG2 basierende thermosensitive Liposomen (TSL) mit Hyperthermie (HT) induzierter zielgerichteter Wirkstofffreisetzung sind eine viel-versprechende Behandlungsstrategie in der Krebstherapie. TSL können als Wirkstoffträgersysteme die Zirkulationszeit und Anreicherung von Wirkstoffen im Zielgewebe erhöhen. Die vielfältigen Krebserkrankungen zeigen unterschiedliches Tumoransprechen auf die routinemäßig eingesetzten Zytostatika. Daher wäre es vorteilhaft, verschiedene Wirkstoffe in TSL einschließen zu können, um Erstlinientherapien weiter zu verbessern. In dieser Arbeit wurden Mitomycin C (Mito) und Gemcitabin (Gem) erstmals in TSL eingeschlossen. Außerdem wurden sie in vitro und in vivo charakterisiert. Die bereits untersuchten TSL(Dox) sollten ihre Vorzüge in einem in dieser Arbeit neuentwickelten orthotopen Blasenkarzinom-Model der Ratte demonstrieren. In Pharmakokinetikstudien wurde die Stabilität der TSL-Formulierungen getestet, die Dosisabhängigkeit untersucht und die Plasmahalbwertszeiten bei wiederholten Injektionen miteinander verglichen. Außerdem wurde eine neue Methode für die Tumorgenerierung und HT-Behandlung in der Rattenblase etabliert. Anschließend wurde die Gewebeverteilung und Tumoranreicherung in der Blase nach Behandlung mit TSL(Dox) +HT untersucht. Die Ergebnisse wurden mit denen der intravesikalen Therapie verglichen. Zusätzlich wurde die Therapieeffizienz von TSL(Gem) im subkutanen Weichteilsarkom untersucht. Die Liposomen wurden durch die Lipidfilmhydratisierungs- und Extrusionsmethode hergestellt und aktiv oder passiv mit Wirkstoff beladen. Die TSL wurden mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung, Dünnschicht-chromatographie, Phosphatbestimmung, Fluoreszenzspektroskopie und HPLC-Analyse charakterisiert. In vivo-Experimente wurden unter Inhalationsnarkose in weiblichen F344 Ratten und männlichen Brown Norway Ratten, durchgeführt. Die HT-Behandlung wurde durch Erwärmung mit Licht oder Wasserbad im Weichteilsarkom-Modell oder einer Blasenspülung mit warmen Wasser im Blasenkarzinom-Modell durchgeführt. TSL(Mito) wiesen eine niedrige Einschlusseffizienz auf und waren in vitro und in vivo sehr instabil. TSL(Gem) und TSL(Dox) hingegen zeigten bei Körpertemperatur eine lange Zirkulationszeit nach intravenöser (i.v.) Verabreichung. TSL(Dox) zeigten bei höherer Verabreichungsdosis eine verlängerte Zirkulationszeit. Wiederholte Injektionen mit TSL(Dox) nach 7 oder 14 Tagen, beeinflussten die Pharmakokinetik des Wirkstoffes nicht. Durch chemische Vorbehandlung der Blase und anschließende Tumorzell-instillation wurde Tumorwachstum in der Blase erzeugt, das nach spätestens 5 Tagen zystoskopisch erkennbar war. Mit kontinuierlicher Spülung mit warmer Flüssigkeit konnte die Blase problemlos für die Behandlungsdauer von 1 h auf 41 °C erwärmt werden. Das Vorhandensein eines Tumors reduzierte die Dox-Aufnahme in die Blasenwand. Bei intravesikaler Therapie mit nicht liposomalem Dox wurden im Urothel bzw. der Tunica muscularis nur 78% bzw. 45% der Konzentration erreicht, die bei systemischen Injektion mit TSL(Dox) +HT erreicht wurde. Die Therapie des Weichteilsarkoms mit Gem zeigte den Vorteil des liposomalen Einschlusses von Gem im Vergleich zum freien Wirkstoff. TSL(Gem) -HT zeigte eine geringfügigere Tumorwachstumsverzögerung verglichen mit freiem Gem ±HT. Die HT induzierte Wirkstofffreisetzung zeigte eine signifikante stärkere Inhibierung des Tumorwachstums verglichen mit allen anderen Gruppen. Die Resultate zeigen, dass nicht alle Wirkstoffe für den Einschluss in auf DPPG2 basierende Liposomen geeignet sind. Die Pharmakokinetik wird bei wiederholter Applikation nicht durch verstärkten Liposomenabbau beeinflusst. TSL und HT zeigten Vorteile in der Anreicherung und Therapie in verschiedenen Tumormodellen. TSL in Kombination mit HT sind eine wertvolle Errungenschaft für die Krebstherapie und sollten weiter untersucht werden.

Abstract

Targeted chemotherapy in solid tumors with thermosensitive liposomes in combination with doxorubicin, gemcitabine and mitomycin C DPPG2-based thermosensitive liposomes (TSL) in combination with local hyperthermia (HT) induced targeted drug delivery are a promising treatment strategy in anticancer therapy. TSL, as a drug carrier system, can improve circulation half-life and accumulation of drugs in target tissue. The variety of cancer types show different therapy response to commonly used cytostatic agents. Therefore it would be advantageous to encapsulate different cytotoxic drugs into TSL for enhanced first line treatment. In this thesis mitomycin C (Mito) and gemcitabine (Gem) were newly encapsulated into TSL and were characterized in vivo and in vitro. The well tested TSL(Dox) were used to show superior in vivo properties compared to free drug in an novel orthotopic rat bladder cancer tumor model. Pharmakokinetic studies were performed to investigate the TSL formulations for stability, to evaluate dose dependency and to compare plasma half-life after repeated injection. Furthermore a new method for rat bladder tumor growth and hyperthermia treatment was developed. The aim was to show tissue distribution and bladder tumor accumulation after the treatment with TSL(Dox) and HT. The results were compared to those of a treatment with intravesical chemotherapy. TSL(Gem) were evaluated for antitumor activity in a subcutaneously growing soft tissue sarcoma model. Liposomes were prepared by the lipid film hydration and extrusion method, followed by active or passive drug loading. TSL were characterized by dynamic light scattering, thin layer chromatography, phosphate assay, fluorescence spectroscopy and HPLC. In vivo-experiments were performed under inhalation anesthesia in female F344 and male Brown Norway rats. HT treatment was performed by light exposure or warm rinse water. For TSL(Mito) low encapsulation efficacy and poor in vitro and in vivo stability even at low temperatures was found. TSL(Gem) and TSL(Dox) showed long circulation half-lifes at body temperature after intravenous (i.v.) injection. For TSL(Dox) an increase in circulation time was observed at higher dose. A repeated injection of TSL(Dox) after 7 or 14 days did not influence pharmacokinetic parameter of the drug. Chemical preconditioning of the bladder and following tumor cell instillation generated bladder tumor growth observable by cystoscopy at least after 5 days. A continuous warm liquid flow was feasible to heat the bladder to 41 °C, for the treatment period of 1 h. Tumor appearance in the bladder is combined with a decrease in Dox uptake into the bladder wall. Intravesical therapy with non-liposomal Dox reached in the urothelium and the muscle layer only 78% and 45% of the concentration achieved with i.v. injected TSL(Dox) +HT, respectively. The therapeutic study with Gem in the rat soft tissue sarcoma demonstrated advantages for liposomal encapsulation over application of free drug. TSL(Gem) -HT showed only small retardation in tumor growth delay over non liposomal Gem ±HT. HT triggered drug release showed significant increase in tumor growth inhibition compared to all other groups. The results show that there is a possibility for successful encapsulation of different drugs into TSL, but not all drugs are suitable. Pharmacokinetic was not influenced by faster degradation after repeated injections. TSL +HT showed advantages in accumulation and therapy in different tumor models. TSL in combination with HT are a feasible tool in cancer therapy and should further be evaluated.