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Hiltwein, Felix Nico (2013): Susceptibility to liver carcinogenesis is increased in a mouse model of conditional E-cadherin deficiency, Die Empfindlichkeit für Leber Karzinogenese ist in einem Maus-Model mit konditionaler E-Cadherin Defizienz erhöht. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

This work employed a mouse model of liver specific depletion of the gene Cdh1 and its respective protein E cadherin to study the role of this protein in liver homeostasis and pathophysiology. The experiment was done with specific focus on the effects concerning hepatocellular carcinoma (HCC) development. Background: Cadherins are present in all higher organisms, and have been studied rigorously in the past. The cadherin family is huge, encompassing more than 400 (known) members. E cadherin is the name-giver of that family and is considered to be of great importance to a broad range of physiological and pathophysiological functions. Known functions include cell-cell adhesion and deregulation of E-cadherin (in almost all cases a down-regulation) is associated with increased aggressiveness in both human and animal tumors. Aside from that, E-cadherin is of great importance during embryogenesis. Worldwide, HCC is an important disease in humans, especially in certain countries (mostly developing countries). While females are only occasionally affected by HCC, it ranks among the top 3 tumor-related death causes in males. The difficulties in treating this tumor curatively make research of genes or proteins relevant to HCC important for human medicine improvement. The existence of a connection between Cdh1 or E Cadherin and HCC has been suggested, but more research is still required. Methods: Employing Cre/loxP technology, a mouse model of liver specific E cadherin depletion was created (L Cdh1del/del). The mice were compared to littermates with normal Ecadherin levels (L Control). Mice body and organ weight was documented at different ages, and liver tissue was analyzed using qRT-PCR (cDNA), Western blot, histochemistry and immunohistochemistry. To test effects of the reduced E-cadherin on tumor development, a cohort of male mice was injected with a chemical carcinogen (DEN) at two weeks of age to induce HCC, and mice were analyzed 4, 8 or 12 months later. Results: Aside from a slight retardation in weight gain, L Cdh1del/del did not suffer from severe health effects or spontaneous tumor development. Histology showed some alterations around the small bile ducts in the liver (in the periportal fields) and RNA analysis showed that mice underwent a phase of considerably altered RNA activity (429 significantly regulated genes at 3 weeks of age), but later only a few up/down-regulated genes remained (28 genes at 6 weeks of age). Aside from Cdh1, no genes considered cadherin family members were regulated. Western blot analysis, qRT-PCR and IHC confirmed that E cadherin was down regulated on RNA level and on protein level in this animal model. All mice injected with DEN developed tumors, but L Cdh1del/del were affected more heavily, with tumors reaching large diameters faster. If mice were kept longer than 8 months, L Cdh1del/del had to be euthanized significantly earlier than L Control. A spin-off of the model was the establishment of a permanent cell line, developed from a liver tumor of a L Cdh1del/del mouse. PCR requiring a functional primer binding site on exon 10 of Cdh1 could not produce DNA product, indicating that the cell line was a derivative of an E-cadherin negative liver cell. Conclusion: Liver specific E cadherin reduction had a surprisingly small effect in the present mouse model (compared to the effects of E cadherin loss in organs like the skin or intestine, as documented in the literature) if mice were not challenged with a chemical carcinogen. If mice were challenged with experimental HCC induction, lack of E cadherin had a strong effect on the tumor growth. These findings attest, by an experimental animal model, the importance of E cadherin for tumor development in the liver. This data reinforces previous observations concerning E cadherin effects on tumors in studies working with resected human tumors of the liver or with conditional organ specific mouse models studying carcinoma in other organs (like the mammary gland, for example). Therefore, this animal model could help improve the understanding of mechanisms regulating aggressiveness in human tumors.

Abstract

Für diese Arbeit wurde ein Mausmodel mit leberspezifischem Ausfall des Gens Cdh1 und des entsprechenden Proteins E-cadherin genutzt, um dessen Bedeutung in der Homöostase und Pathophysiologie der Leber zu untersuchen. In diesem Experiment wurde dabei besonders viel Wert auf die Effekte gelegt, welche die Entwicklung von Hepatozellulärem Karzinom (HCC) betreffen. Hintergrund: Cadherine gibt es in allen höheren Organismen, und an ihnen wurde bereits intensiv geforscht. Die Cadherin Familie ist zahlreich und umfasst mehr als 400 (bekannte) Proteine. E cadherin, das ursprünglich namensgebende Protein der Familie, wird mit einer großen Bandbreite an Funktionen in Physiologie und Pathophysiologie assoziiert. Bekannte Funktionen umfassen den Zell-Zell-Zusammenhalt, und eine Deregulation von E cadherin (in fast allen Fällen eine Herabregulation) wird mit einer vermehrten Aggressivität von Tumoren in Zusammenhang gebracht. Abgesehen davon hat E cadherin auch noch große Bedeutung in der Embryogenese. Weltweit ist HCC eine wichtige Erkrankung des Menschen, speziell in bestimmten Ländern (sogenannten “Entwicklungsländern”). Frauen sind zwar verhältnismäßig selten davon betroffen, aber unter Männern nimmt HCC einen der drei Spitzenplätze ein was (Tumor-assoziierte) Todesursachen angeht. Die Schwierigkeiten diesen Tumor kurativ zu behandeln, bedingen dass Forschung an Genen oder Proteinen mit Bedeutung für HCC von Wichtigkeit für eine Verbesserung der Humanmedizin ist. Dass eine Verknüpfung zwischen Cdh1/E Cadherin mit HCC besteht ist bereits bekannt, dennoch ist eine gründlichere Forschungsarbeit notwendig. Methodik: Unter Benutzung der Cre/loxP Technologie wurden Mäuse mit einem leberspezifischem Verlust von E cadherin generiert (L Cdh1del/del). Die Mäuse wurden mit Wurfgeschwistern mit normalen E cadherin Status (L Control) verglichen. Körper- und Organgewicht wurde zu mehreren Zeitpunkten gemessen, und Lebergewebe wurde mit qRT-PCR (cDNA), Western blot, Histochemie und Immunhistochemie untersucht. Um den Effekt von reduziertem E cadherin auf die Tumorentwicklung zu testen, wurde eine Gruppe männlicher Mäuse im Alter von zwei Wochen mit einem chemischen Karzinogen (DEN) behandelt um HCC zu erzeugen. Die Mäuse wurden 4, 8, oder 12 Monate später untersucht. Ergebnisse: Abgesehen von einer leicht verringerten Gewichtszunahme waren L Cdh1del/del gesundheitlich weitestgehend unbeeinflusst durch den E cadherin Verlust. Histologisch waren jedoch einige Veränderungen an/um die feinen Gallengänge (im Periportalfeld) zu erkennen. Eine Messung der RNA ergab, dass die Mäuse eine Phase erheblich veränderter RNA Aktivität durchlaufen (429 signifikant regulierte Gene im Alter von 3 Wochen), aber nicht viele dieser Gene bleiben längerfristig hochreguliert (nur noch 28 im Alter von 6 Wochen). Abgesehen von Cdh1 war kein Mitglied der Cadherin Familie auf RNA Ebene signifikant reguliert. Mit Hilfe von qRT-PCR, Western Blot und IHC konnte bewiesen werden, dass E cadherin in diesem Tiermodell auf RNA und auf Protein Ebene herabreguliert ist. Alle mit DEN injizierte Mäuse entwickelten Tumore, aber L Cdh1del/del Mäuse waren stärker betroffen. Hier erreichten Tumore bereits früher große Durchmesser. Wenn Mäuse länger als 8 Monate nach Karzinogengabe gehalten wurden, mussten L Cdh1del/del signifikant früher euthanasiert werden als L Control. Ein Nebenprodukt dieses Models war die Etablierung einer permanenten Zelllinie aus der Leber einer L Cdh1del/del Maus. Eine PCR, welche eine funktionierende Primer Bindungsstelle auf Exon 10 des Cdh1 Gens benötigt, konnte kein DNA Produkt vermehren. Dadurch konnte bewiesen werden, dass die etablierte Zelllinie ein Abkömmling einer E cadherin negativen Leber Zelle war. Schlussfolgerung: Leberspezifischer Verlust von E cadherin hat einen überraschend schwachen Effekt in einem Mausmodel (verglichen mit dem aus der Literatur bekannten Effekt von E cadherin Verlust in Organen wie z.B. Haut oder Darm) solange die Mäuse nicht mit einem weiteren Faktor (einem Kanzerogen) konfrontiert werden. Litten die Mäuse an HCC, so hatte der Mangel an E cadherin einen starken Effekt auf das Tumorwachstum. Dies ist ein tierexperimenteller Beweis für die Bedeutung von E cadherin für Tumorentwicklung in der Leber. Das Ergebnis bestätigt frühere Erkenntnisse betreffs des Zusammenhangs zwischen E cadherin und Tumoren, welche an resezierten Lebertumoren aus der Humanmedizin und anhand von anderen konditionalen E-cadherin defizienten Mausmodellen (z.B. Karzinogene der Milchdrüse) gewonnen wurden. Das verwendete Mausmodell könnte also zu einem besseren Verständnis der Mechanismen dienen, welche die Aggressivität von Tumoren steuern.