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Gondi, Gábor (2013): Einfluss eines Carboanhydrase XII-spezifischen Antikörpers auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo sowie Onkosomen-basierte Generierung neuer tumorreaktiver Antikörper. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

In dieser Arbeit wurden Mikrovesikel, die von Tumor-Zelllinien in hohen Konzentrationen sekretiert wurden, zur Immunisierung von Ratten verwendet, um auf diese Weise monoklonale Anti-körper gegen membranständige Proteine zu generieren, die auf Tumorzellen vorhanden sind. Der Grund für diesen Ansatz ist, dass Mikrovesikel verschiedenste Membranproteine enthalten, die in Tumorzellen in hohem Maße exprimiert werden. Diese Mikrovesikel sind etwa hundertfach kleiner als die Zellen, denen sie entstammen und daher deutlich weniger komplex. Gleich-zeitig enthalten sie aber überproportional viele Membran-proteine. Viele, aber nicht alle dieser Proteine sind in der Onko-logie und Tumorimmunologie bereits als Tumor-assoziierte Antigene bekannt, weshalb diese Mikrovesikel hier als Onko-somen bezeichnet werden. Es hat sich herausgestellt, dass sich Onkosomen hervorragend zur Immunisierung verwenden lassen und durch ihre Immunogenität die Möglichkeit bieten, mono-klonale Antikörper gegen zunächst unbekannte, aber onko-logisch relevante Membranproteine zu generieren. Aus solchen Immunisierungen war in der Arbeitsgruppe der Antikörper 6A10 hervorgegangen, der mit hoher Spezifität und Effizienz die Tumor-assoziierte Carboanhydrase XII (CA XII) er-kennt und inhibiert. CA XII ist ein membranständiges Enzym, das auf einer Vielzahl hypoxischer Tumoren exprimiert ist und für die Homöostase des leicht alkalischen intrazellulären pH-Wertes vieler Tumorzellen entscheidend ist. Mit dem inhibitorischen Antikörper 6A10 konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass eine spezifische Hemmung der CA XII-Enzymaktivität zu einem ver-zögerten Wachstum dreidimensionaler Tumorzellverbände in vitro und in vivo führt. Bei den in-vivo-Versuchen konnte ich dabei das Wachstum von Luziferase-exprimierenden Tumoren in immundefekten NSG-Mäusen durch Biolumineszenz-basierte Bildgebung (BLI) über lange Zeiträume exakt verfolgen und quantifizieren. Mittels Fluoreszenz-basierter Bildgebung konnte ich zudem die spezifische Bindung eines 6A10-Infrarotfarbstoff-Konjugates an Tumorzellen in vivo visualisieren. Da es zuvor keinen spezifischen Inhibitor gegen die CA XII gab, waren dies die ersten Untersuchungen, die speziell die CA XII als Ziel-struktur behandelten und für die klinische Onkologie als relevantes Tumor-assoziiertes Antigen validieren konnten. In einem zweiten Teil meiner Arbeit ermittelte ich die Spezifität weiterer Tumor-reaktiver Antikörper, die aus Immunisierungen mit Onkosomen hervorgegangen sind. Diese Antikörper erkann-ten nativ gefaltete Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen und könnten zur Beantwortung verschiedener onkologischer Fragestellungen Verwendung finden. Neben dieser unspezi-fischen „reversen“ Immunisierungsmethode, verwendete ich Onkosomen erfolgreich auch zur gezielten Generierung von Antikörpern gegen ein definiertes membranständiges Protein, die humane Carboanhydrase IX. Die CA IX ist ein weiteres be-kanntes membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das oft mit der Carboanhydrase XII auf invasiven soliden Tumoren ko-exprimiert ist. Damit konnte ich belegen, dass sich Mikrovesikel nicht nur für die Generierung neuartiger Tumor-reaktiver Anti-körper, sondern auch für die Entwicklung von Antikörpern gegen ein Molekül der Wahl eignen. Die Immunisierung mit nativ ge-falteten Proteinen im Kontext immunogener Mikrovesikel könnte sich zukünftig als Möglichkeit zur Generierung von Antikörpern erweisen, die mit klassischen Immunisierungsmethode nicht oder nur schwer zu erhalten sind.

Abstract

Tumours and established tumour cell lines constitutively secrete high amounts of microvesicles (MVs) less than 200 nm in dia-meter. These vesicles display various proteins in their mem-branes, which are frequently found to be strongly upregulated in the cells of origin. MVs used in this work are roughly a hundred times smaller than cells and less complex because they contain predominantly membrane-bound proteins, many of them being well known to oncologists and tumour immunologists as tumour-associated antigens. Therefore, these particles are hereinafter referred to as oncosomes. Previous work of our group has identified oncosomes derived from different tumour cell lines as excellent tools for immunizations aiming at the generation of monoclonal antibodies against initially unknown, but oncologically relevant proteins. A monoclonal antibody (6A10) that specifically inhibits CA XII activity was recently generated in my group with the help of such microvesicles. In this work, using the 6A10 antibody, I was able to demonstrate that blocking CA XII-enzyme activity interferes with the growth of three-dimensional tumour cell clusters both in vitro and in vivo. In severely immunocompromised NSG mice, the growth rates of luciferase-expressing tumor xenografts were monitored and precisely quantified by whole-body bioluminescence-based imaging (BLI) over the entire duration of the experiment. Additionally, specific binding of 6A10 con-jugated to an infrared dye to tumour cells in vivo was visualized by means of fluorescence-based imaging. Because no specific inhibitor oft CA XII was available so far, this work represents the first study on CA XII as a target for an immunotherapeutic intervention, proving the enzyme as a relevant tumour-associated antigen for clinical oncology. As a second project, I made use of the unique composition and high immunogenicity of oncosomes in that I utilized them as tools for the generation of new tumour-reactive monoclonal antibodies, which I subsequently characterized and determined the specificities of some of them using immunoprecipitations and mass spectrometry. Interestingly, the majority of antibodies obtained from immunizations recognized natively folded protein antigens, which were found to be strongly expressed on the surface of a variety of tumour cell lines and thus may find use in diagnostic or even therapeutic approaches. Besides their application in this rather random immunization strategy, I successfully used recombinant oncosomes for the targeted generation of antibodies against a particular protein (membrane-associated carbonic anhydrase IX). Here, CA IX was chosen as a membrane-tethered tumour-associated antigen, which is often co-expressed alongside with carbonic anhydrase XII on various invasive solid cancers types. CA IX is another membrane-bound enzyme expressed on a variety of hypoxic tumours and critical to the homeostasis of the slightly alkaline intracellular pH of many tumour cells. This approach proves that microvesicles not only are suitable for the identification of novel tumour-reactive antigens and generation of antibodies, but also for selective production of antibodies specific to a molecule of choice. Thus, microvesicles engineered to carry a specific protein as natively folded immunogen can be used to generate anti-bodies with particular features, i.e. recognition of proteins in their native tertiary struc-ture – a prerequisite for functional antibodies.