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Pan, Jie (2013): Molecularly targeted therapy on a new preclinical mouse model for gastric neuroendocrine tumors. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Neuroendocrine tumors are a heterogeneous group of malignancies with an increasing prevalence. Since there is not much progress in therapy, model systems are urgently needed. We have a CEA424-SV40 TAg transgenic mouse model which develops spontaneous tumors in the antral region of the stomach. In addition, several cell lines derived from the tumor were established. Gene expression analysis of the tumor tissue as well as cell lines revealed neuroendocrine markers. Therefore we further characterized this model with special emphasis on the cells of origin and used it for testing new targeted treatment protocols. To analyze CEA424-SV40 TAg mouse model in more detail, tumor tissue as well as the cell lines derived from the primary tumor were investigated by immunohistochemistry, immunofluorescence, western blot, and ELISA. Antibodies used were directed at SV40 TAg, Ki-67, chromogranin A, chromogranin B, secretin, H+-K+-ATPase, glucagon, and transcription factors NeuroD1 and Nkx2.2. Plasma hormone levels of serotonin and secretin were measured by ELISA. Immunostainings of SV40 TAg and Ki-67 revealed highly proliferative tumors cells. The tumors stained intensively for the neuroendocrine markers chromogranin A, chromogranin B, secretin and glucagon. The tumor tissue as well as the cell lines expressed transcription factors NeuroD and Nkx2.2, which are involved in the differentiation of the neuroendocrine lineage. Hormone levels of serotonin and secretin in the plasma of the transgenic mice were dramatically elevated when compared with normal littermates, thus supporting the neuroendocrine phenotype. As the neuroendocrine phenotype of CEA424-SV40 TAg transgenic mouse was confirmed, molecularly targeted therapies were tested in this model system both in vitro and in vivo. Cell lines were tested for drug sensitivity with mTOR inhibitors (RAD001, NVP-BEZ235), paclitaxel, E2F inhibitor, HSP90 inhibitor, and p53 stabilizer Nutlin-3a. All the drugs tested in vitro could efficiently inhibit cell proliferation in a dose dependent manner. From these drugs the mTOR inhibitor RAD001 was chosen for the in vivo experiment. Daily feeding of 10 mg/kg RAD001 inhibited the tumor development and prolonged the survival time of the CEA424-SV40 TAg transgenic mice dramatically. The effects of the RAD001 treatment on tumor cells were achieved mainly through inactivating mTOR-p70S6K and mTOR-4EBP1 signaling as proven by western blot and immunohistochemistry. Still, some cells must develop escape mechanisms, since the tumor tend to grow. To gain a better understanding of the T antigen transforming mechanisms as well as the possible escape mechanisms, some efforts were made on the tumor originating cells in the CEA424-SV40 Tag transgenic mouse model. Possible candidates for these tumor originating cells in the stomach are the newly described epithelial as well as mesenchymal stem cells. In a first attempt, the expression feature of epithelial and mesenchymal stem cell markers were analyzed. Established cell lines as well as tumor tissue from the tumor bearing mice were investigated by reverse transcription PCR (RT-PCR), immunohistochemistry, immunofluorescence, western blot, and microarray analysis. From several markers analyzed, the tumor cell lines showed a high expression level of the potential epithelial stem cell marker Bmi1 in RT-PCR and cDNA expression array. This could be further substantiated by western-blotting and immunostaining. Consequently, Bmi1 message could also be found in the growing tumors both in mRNA and protein levels. Experiments using siRNA to knock down the SV40-TAg expression showed that the Bmi1 expression went down in the cell lines thus showing the interrelationship. On the other hand, the mesenchymal stem cell marker Etv1 was also found to be expressed in the tumor tissue and cell lines derived from the tumor. More interestingly, Etv1 expression level was up-regulated over the time course of the tumor development. From these, an Etv1 positive mesenchymal cell could be a possible candidate for transformation. Since the CEA-promoter used for the generation of the T-antigen transgenic animals contains Etv1 binding sites, it is tempting to speculate, that this may drive the transcription of the T antigen. In conclusion, our data provide convincing evidence that CEA424-SV40 TAg mice are a clinically relevant model for neuroendocrine tumor. Testing of molecularly targeted therapies both in vitro and in vivo offered promising candidates for further clinical evaluation. Thus, this new model system could be of great value not only for studies on the mechanisms of how SV40 TAg induces neuroendocrine tumors but also for exploring novel targeted therapy in a preclinical setting.

Abstract

Neuroendokrine Tumore stellen heterogene Tumore mit ansteigender Prävalenz dar. Da es nur geringe Verbesserungen in der Therapie gibt, besteht ein Bedarf an neuen Modellsystemen. In unserer Arbeitsgruppe wurde das CEA424-SV40-T-Antigen transgene Mausmodell entwickelt, in welchem sich spontan Tumore im Bereich des Magenantrums bilden. Gleichzeitig wurden Zelllinien aus diesem Tumor etabliert. Die Analyse der Genexpression im Tumor und in den Zelllinien ergaben Hinweise auf einen neuroendokrinen Tumortyp. Deshalb wurde der Phänotyp des Tumors auch mit Blick auf den Ursprung der Tumore analysiert und für die Testung von Therapieoptionen eingesetzt. Die Analyse der CEA-424-SV40-TAg-Mäuse sowie der Tumorlinien wurden mittels Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Westernblot und ELISA untersucht. Dazu wurden Antikörper gegen das SV40-T-Antigen, den Proliferationsmarker Ki-67, Chromogranin A, Chromogranin B, Sekretin, die H-K-ATPase, Glukagon und die Transkriptionsfaktoren NeuroD und Nkx2.2 eingesetzt. Die Plasma Hormonkonzentrationen von Serotonin und Sekretin wurden mittels ELISA bestimmt. Die Färbung für das SV40-T-Antigen und Ki-67 zeigte einen hoch proliferierenden Tumor. Dieser war hoch positiv für die neuroendokrinen Marker Chromogranin A, Chromogranin B, Sekretin und Glukagon. Sowohl der Tumor als auch die Tumorzelllinien exprimierten die Transkriptionsfaktoren NeuroD und Nkx2.2, welche an der Differenzierung von neuroendokrinen Zellen beteiligt sind. Die Hormonkonzentrationen von Serotonin und Sekretin waren im Plasma der transgenen Mäuse deutlich erhöht. Dies ergab das Gesamtbild eines neuroendokrinen Karzinoms. In diesem Modell wurden nun verschiedene molekular begründete Therapien in vitro und in vivo getestet. So wurde an den Zelllinien die Empfindlichkeit von mTOR Inhibitoren (RAD001, NVP-BEZ235), Paclitaxel, E2F -Inhibitor, Hsp90-Inhibitor und dem p53 Inhibitor Nutlin3 getestet. Alle verwendeten Substanzen konnten die Proliferation der Tumorzellen dosisabhängig hemmen. Von diesen wurde dann der mTOR Inhibitor RAD001 für die in vivo Anwendung ausgewählt. RAD001 konnte dabei die Entwicklung der Tumore signifikant hemmen und verlängerte das Überleben der Tiere dramatisch. Der Effekt der mTOR Inhibition bestand dabei vor allem in der Hemmung des mTOR-p70S6K und mTOR-4EBP1 Pathways, was im Westernblot und der Immunhistochemie gezeigt werden konnte. Trotzdem muss festgehalten werden, dass einige Tumorzellen der Therapie entkommen konnten. Um nun Informationen über den Transformations- und den Escape-Mechanismus zu bekommen, wurde versucht die Tumorursprungszelle zu beschreiben. Mögliche Kandidaten dafür sind sowohl die jüngst beschriebenen intestinalen Epithelstammzellen als auch mesenchymale Stammzellen. Dazu wurden Marker-Gene an den etablierten Zelllinien und den Tumoren mit Hilfe von RT-PCR, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Westernblot und Microarray untersucht. Dabei fand sich in den Tumorzellen eine hohe Expression des möglichen epithelialen Stammzellmarkers Bmi1. Dies konnte auch im Westernblot und in der Immunfärbung bestätigt werden. Folgerichtig fand sich dieser Marker auch in den wachsenden Tumoren. Experimente, in denen mit siRNA die Expression des SV40-T- Antigen blockiert wurde, ergaben eine Reduktion der Bmi1-Expression und weisen damit auf einen engen Zusammenhang hin. Gleichzeitig fand sich allerdings auch eine hohe Expression des mesenchymalen Stammzell-Markergenes Etv1 im Tumor und in den etablierten Zelllinien. Etv1 stieg dabei im Verlauf der Tumorentwicklung im Gewebe deutlich an. Deshalb könnte es sich bei der ursprünglich transformierten Zelle auch um eine mesenchymale Stammzelle handeln. Da der CEA Promotor, der die Expression des SV40-T-Antigens in den transgenen Mäusen regulieren soll, einige Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor Etv1 hat, liegt die Möglichkeit der Induktion des T-Antigens über Etv1 nahe. Dazu stehen aber noch weitere Experimente aus. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten, dass es sich bei dem CEA424-SV40 Tag-Mausmodell um ein klinisch relevantes Modell für einen neuroendokrinen Tumor handelt. Zusammen mit den etablierten Tumorzelllinien können daran neue Therapieansätze getestet werden. Damit bietet es die Möglichkeit sowohl den Zusammenhang zwischen dem T-Antigen und der Entwicklung des neuroendokrinen Phänotyps als auch neue Therapieformen zu untersuchen.