Abstract

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.