Ceramidsynthese in Saccharomyces cerevisiae

Ceramidsynthese in Saccharomyces cerevisiae

The work presented in this dissertation gave the following results: (i) Sequence homologous of the membrane proteins Lag1p and Dgt1p exist all over the kingdom of eucaryotes. All of them share a highly conserved motif with two hydrophilic residues within a transmembrane domain. A limited proteolytic digestion showed, that the N-terminus of Dgt1p is orientated to the cytosolic side. Together with the in silicio analysis, the proteins of the LAG family have six transmembrane domains, a cytosolic C-terminus and an ER lumenal loop of ca. 45 amino acids. (ii) Different mutants of Dgt1p showed, that the C-terminus is essential for the function of the protein. The soluble N-terminus or its dilysine motif, normally mediating retrieval of ER resident proteins that escaped to the Golgi, have not obvious importance for Dgt1p. (iii) Lag1p and Dgt1p fulfill their function in the membrane of the ER and are no constitutive parts of COPII transport vesicles. Moreover, both proteins interact with each other and therefore appear to form a heteropolymeric complex in the ER membrane. (iv) The synthesis rates of complex sphingolipids are drastically reduced in the absence of LAG1 and DGT1. Consequently, lag1Ddgt1D cells have a decreased portion of sphingolipids compared to the wild type. The lipid defekt is not due to lacking phosphoinositolation of ceramide, since the catalytic activity of the corresponding enzyme was proven in vivo.(v) The synthesis block in lag1Ddgt1D cells leads to an accumulation of sphingoid bases. In this connection it was shown, that Lag1p and Dgt1p are essential for the incorporation of exogenous dihydrosphingosine into ceramide, whereas in their absence endogenous dihydrosphingosine is converted to ceramide with a merely decreased rate. The elongation of fatty acids to C26 is not reduced in lag1Ddgt1D cells. Lipid extracts of fumonisin B1 treated wild type cells resemble that of the double mutant, whereas the latter is not influenced by a toxin based inhibition of ceramide synthase. Overexpression of LAG1 and DGT1 does not lead to an overproduction of ceramide or sphingolipids. However, a direct in vitro assay for ceramide synthase activity finally proved the essential requirement of the reaction for Lag1p and Dgt1p. (vi) The overproduction of the ceramidases Ypc1p and Ydc1p in lag1Ddgt1D cells increases the synthesis rates as well as the effective amounts of complex sphingolipids. The defective incorporation of exogenous dihydrosphingosine into ceramide was, however, not reverted. The additional deletion of YPC1 and YDC1 in the absence of LAG1 and DGT1 decreased the amounts of inositol containing sphingolipids beyond detectable levels and, therefore, confirmed the essential requirement of Lag1p and Dgt1p for the ceramide synthase reaction. (vii) The survival of lag1Ddgt1D cells compared to wild type cells after short heat shock is drastically impaired. Moreover, the ability of yeast to form single cells on agar plates directly contributes to the temperature and the amount of ceramide available. As a consequence of the data obtained, the proteins Lag1p and Dgt1p are the first to be characterized as essential parts of the ceramide synthase reaction., Im Rahmen dieser Dissertation wurden im wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt: (i) Sequenzhomologe der Membranproteine Lag1p und Dgt1p existieren ubiquitär im eukaryontischen Reich. Allen gemein ist ein hochkonserviertes Motiv, welches sich u.a. durch zwei hydrophile Reste innnerhalb eines Transmembransegments auszeichnet. Ein limitierter proteolytischer Verdau zeigte, daß der N-Terminus von Dgt1p cytosolisch orientiert ist. Im Zusammenhang mit in silicio-Analysen ergeben sich für die Familie der LAG-Proteine sechs Transmembran-domänen, ein cytosolischer C-Terminus und ein ER-lumenalen Bereich mit ca. 45 Aminosäuren. (ii) Verschiedene Mutationen von Dgt1p belegen, daß der stark negativ geladene C-Terminus essentiell für die Funktion des Proteins ist. Der lösliche N-Terminus oder dessen Dilysinmotiv, welches den retrograden Transport ER-residenter Proteine vermittelt, besitzen indes keine offensichtliche Bedeutung für Dgt1p. (iii) Lag1p und Dgt1p erfüllen ihre Funktion in der ER-Membran und sind kein konstitutiver Bestandteil von COPII-Transportvesikeln. Beide Proteine interagieren miteinander und scheinen so einen heteropolymeren Komplex in der ER-Membran auszubilden. (iv) Die Syntheseraten komplexer Sphingolipide sind in Abwesenheit von LAG1 und DGT1 drastisch reduziert. In Folge besitzen lag1Ddgt1D-Zellen einen vergleichsweise geringeren Anteil von Sphingolipiden an der Gesamtlipidmenge. Der Lipiddefekt ist nicht in einer fehlerhaften Phosphoinosilierung von Ceramid begründet, da die Aktivität des entsprechenden Enzyms in vivo nachgewiesen wurde.(v) Der Syntheseblock in lag1Ddgt1D-Zellen führt zu einer Akkumulation von Sphingoidbasen. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß Lag1p und Dgt1p für den Einbau von exogenem Dihydrosphingosin in Ceramid essentiell sind, wohingegen in deren Abwesenheit endogenes Dihydrosphingosin mit einer lediglich reduzierten Rate zu Ceramid konvertiert wird. Die Fettsäureelongation zu C26 ist in lag1Ddgt1D-Zellen nicht reduziert. Lipidextrakte von Fumonisin B1-behandelten Wildtypzellen ähneln denen der Doppelmutante, wohingegen letztere von einem toxininduzierten Block der Ceramidsynthase nicht beeinflußt wird. Die Überexpression von LAG1 und DGT1 bewirkt keine Überproduktion von Ceramid oder Sphingolipiden. Ein direkter Test der Ceramidsynthase in vitro bewies schließlich, daß Lag1p und Dgt1p für diese Reaktion essentiell sind. (vi) Die Überproduktion der Ceramidasen Ypc1p und Ydc1p in lag1Ddgt1D-Zellen erhöht sowohl die Syntheserate als auch die effektiven Mengen komplexer Sphingolipide. Der fehlerhafte Einbau von exogenem DHS in Ceramid wird dadurch nicht revertiert. Die zusätzliche Deletion von YPC1 und YDC1 in der Abwesenheit von LAG1 und DGT1 reduziert das Niveau inositolhaltiger Sphingolipide unter detektierbare Grenzen und bestätigt so die essentielle Bedeutung von Lag1p und Dgt1p für Ceramidsynthasereaktion. (vii) Das Überleben von lag1Ddgt1D-Zellen nach einem kurzen Hitzeschock ist im Vergleich zum Wildtyp drastisch eingeschränkt. Darüberhinaus steht die Fähigkeit zur Formierung von Einzelkolonien auf Agarplatten in einem direkten Zusammenhang mit der Temperatur und der Menge an verfügbarem Ceramid. Aufgrund der erzielten Daten konnten zum ersten Mal die Proteine Lag1p und Dgt1p als essentielle Bestandteile der Ceramidsynthasereaktion charakterisiert werden.

Not available

02. Apr. 2001

2001

Deutsch

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:19-3658