Abstract

6.1. Die PH-Domäne als Paratop Die Pleckstrin-homologe (PH-) Domäne des humanen Cytohesin-1 besteht aus einem Proteingerüst sowie vier längeren Loops. Von diesen weisen drei in eine Richtung und bilden eine komplexe, flexible Oberflächenstruktur aus. Sollte man diese Oberflächenstruktur durch Mutation der Loops als Bindungstasche (Paratop) für Epitope von Schlüsselmolekülen etablieren können, wäre ein breiter Einsatz der PH-Domäne als Wirkstoff oder spezifisches Nachweisreagenz interessant, zumal sie sich in E. coli mit hohen Ausbeuten cytoplasmatisch löslich exprimieren läßt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die drei Loops verändern lassen, ohne daß die PH-Domäne ihre Struktur verliert; von daher eignet sich die PH-Domäne als Proteingerüst. Sie wurde insgesamt in 29 Aminosäurepositionen mit einem neuartigen Verfahren gewichtet randomisiert, indem an jeder Position die Wildtyp-Aminosäure bevorzugt wird. In Anbetracht der Zahl randomisierter Positionen sollte damit gegenüber einer ungewichteten Randomisierung kein Verlust an Komplexität für die Bibliothek zu befürchten sein, durch den möglichen Erhalt lokaler und nicht lokaler Wechselwirkungen aber die Zahl stabiler (damit exprimierbarer und selektierbarer) Mutanten deutlich erhöht werden. Die Randomisierung erfolgte dabei mit drei Oligodesoxynukleotiden, die in den randomisierten Positionen jeweils eine definierte Basenverteilung aufweisen. Zur Klonierung einer Bibliothek wurden sie im dazu entwickelten Verfahren der „asymmetrischen PCR-Reaktion“ eingesetzt und daraufhin zu einem in drei Segmenten randomisierten DNA-Fragment assembliert. Mit dieser Strategie konnten 6 · 107 Mutanten erzeugt werden. (Aus deutlich kleineren Bibliotheken anderer Proteine ließen sich bereits bindende Mutanten isolieren.) Die randomisierten Mutanten der PH-Domäne wurden im phage-display-Verfahren zur Selektion gegen drei Zielsubstanzen eingesetzt. Danach konnten ausschließlich Deletionsmutanten und Mutanten mit stop-Codons nachgewiesen werden, die keine Expression von PH-Domänen erlauben. Zurückgeführt wird dieses Ergebnis auf die schlechten Transporteigenschaften der PH-Domäne bei der Translokation in das Periplasma von E. coli, weshalb nicht auf bindende Paratope aus der Bibliothek selektiert werden konnte. Nach Verbesserung der Translokationseigenschaften von PH-Domänen sollte sich das phage-display-Verfahren zur Selektion bindender Mutanten fortsetzen lassen. 6.2. Die PH-Domäne als Substrat für Translokationen Die im phage-display-Verfahren eingesetzten M13-Bakteriophagen assemblieren in der inneren Membran von E. coli. Dies setzt die Translokation der mit dem g3-Protein fusionierten PH-Domäne in das Periplasma voraus. Die geringe periplasmatische Expression bei mehrheitlich aberranten Prozessierungen im Bereich des Signalpeptids und die geringe Darstellung auf der Phagenoberfläche veranlaßten zur Translokationsoptimierung der PH-Domäne. Während der allgemeine sekretorische Transportmechanismus von E. coli durch die beteiligten Membranproteine strukturell und funktionell gut verstanden ist, sind die Eigenschaften und Voraussetzungen für die Translokation von Substratproteinen (mit Signalpeptid als Präprotein bezeichnet) bislang weniger gut charakterisiert. Der „translokationskompetente“ Zustand beschreibt die Präproteine nur phänomenologisch. Für die schlechte Translokation wurden mehrere biochemische und biophysikalische Eigenschaften der PH-Domäne in Betracht gezogen und verschiedene Mutanten hergestellt, die demzufolge eine verbesserte Translokationseigenschaft aufweisen sollten. Dabei erwies sich weder die Verringerung der thermodynamischen Stabilität noch das engineering ausgewählter, spezifischer Sequenzelemente als translokationsbegünstigend. Wird dagegen durch Einführung neuer N- und C-Termini sowie der Verbrükkung der ursprünglichen Termini mit einem Linker die Topologie verändert, können bei zwei dieser sogenannten Circularpermutanten bis zu 30-fach höhere Expressionsausbeuten im Periplasma erzielt werden. Die Circularpermutation wurde damit erstmalig erfolgreich im rationalen Proteindesign angewendet. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, daß die Mutanten der PH-Domäne vor der Translokation in einem nativ-ähnlichen Zustand gefaltet vorliegen und zur Translokation entfaltet werden müssen. Das in dieser Arbeit vorgeschlagene „Kräftemodell“ erklärt die verbesserte Translokation der Circularpermutanten CP X.6. gegenüber dem Wildtyp. Danach ist die maximale Kraft zur Entfaltung des Proteins die translokationslimitierende Größe, was sich mit Hilfe von Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie weiter untersuchen ließe. Wie sich die Mutationen an der PH-Domäne bei weiteren Transportprozessen auswirken, wurde beim mitochondrialen Import analysiert. Die untersuchten Mutanten zeigten unabhängig von ihrer thermodynamischen Stabilität und ihrer periplasmatischen Expression eine Unterbrechung des Imports. Ursache dafür ist eine Peptidsequenz von 27 Aminosäuren, die sich mit Hilfe der Circularpermutanten eindeutig identifizieren läßt. Sie führt bei der Circularpermutante CP 2.6. zu einer stabilen Expression im Intermembranraum und beim Wildtyp sowie bei der Circularpermutante CP 2.7. zu einem Verharren in der inneren Membran. Bei Mitochondrien konnte zuvor noch nie eine importunterbrechende Peptidsequenz nachgewiesen werden. Sie sollte sich zur stabilen Expression von Proteinen im Intermembranraum einsetzen lassen. In der (modellierten) Raumstruktur der PH-Domäne interagieren 19 der 27 Aminosäuren in einem Faltblatt/turn/Faltblatt-Motiv. Sie könnten als stabile Subdomäne den Import unterbrechen. Diese Interpretation ergänzt ein Modell zur Translokation von Präproteinen, wonach das Präprotein vom Intermembranraum schrittweise durch die innere Membran (bzw. den TIM-Komplex) in die Matrix diffundiert und dort arretiert wird. Dadurch wird die Rückdiffusion verhindert. Die Unterbrechung des weiteren Imports währt solange, bis aufgrund des thermodyamischen Gleichgewichts die Peptidsequenz vor der Membran entfaltet vorliegt und dann in die Matrix diffundieren kann. Ergänzende Experimente zum mitochondrialen Import sind in Vorbereitung. In dieser Arbeit konnte die PH-Domäne mit ihren Mutanten somit als Substrat für die Untersuchung von Transportprozessen etabliert werden. Die zukünftige Anwendung dieser Mutanten auf weitere Transportsysteme liegt dabei auf der Hand. Die Bibliothek randomisierter PH-Domäne wird in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen zur Selektion spezifisch bindender und inhibierender Mutanten eingesetzt.