Abstract

Zyklisches 3’:5’-Adenosinmonophosphat (cAMP) ist sowohl als extrazellulärer Lockstoff als auch als intrazelluläres Signalmolekül von entscheidender Bedeutung in der Entwicklung von Dictyostelium discoideum. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass dieser sekundäre Botenstoff auch eine zentrale Rolle in der hyperosmotischen Stressantwort von D. discoideum spielt. Wildtypzellen reagieren auf hyperosmotischen Stress mit einem transienten Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration, der von dem Hybridhistidinkinase-Homolog DokA abhängig ist. DokA ist essentiell für das Überleben von D. discoideum-Zellen unter hyperosmotischen Bedingungen. Die Osmosensitivität von dokA--Zellen beruht auf dem gestörten cAMPMetabolismus und kann durch die transiente Zugabe eines membrangängigen cAMP-Analogs weitgehend aufgehoben werden. Der Einfluss von DokA auf den intrazellulären cAMP-Spiegel zeigt sich auch in ungeschockten Zellen: Während die basale cAMP-Konzentration in dokA-- Zellen reduziert ist, weisen Zellen, die die Regulator-Domäne von DokA überexprimieren, einen erhöhten cAMP-Spiegel auf. Basierend auf diesen Daten wurde ein Modell der Regulation des intrazellulären cAMP-Spiegels durch DokA entwickelt. Die Regulator-Domäne von DokA wirkt hierbei als Phosphatase des Histidin-Phosphotransferproteins RdeA, welches durch Phosphorylierung die Phosphodiesterase RegA aktiviert. Durch die Phosphatase-Aktivität von DokA wird somit der über den RdeA/RegAPhosphorelay gesteuerte intrazelluläre cAMP-Abbau inhibiert. Die in vitro-Dephosphorylierung von RdeA durch die Regulator-Domäne von DokA konnte ebenso nachgewiesen werden wie die verringerte Phosphodiesterase-Aktivität bei homologer Überexpression des DokA-Regulators. Die Effekte dieser Überexpression auf cAMP-Haushalt und Entwicklung sind DokA-spezifisch und von dem konservierten Aspartylrest D1567 der Regulator-Domäne abhängig. Bei Untersuchungen zu den Effektoren der hyperosmotischen Stressantwort in D. discoideum wurden Veränderungen in Aufbau und Zusammensetzung von Membran und Cytoskelett beobachtet. Dabei konnten sieben Proteine identifiziert werden, die eine deutliche Translokation bei hyperosmotischem Stress erfahren. Eine Übersicht stellt die osmoregulatorischen Signalwege in D. discoideum dar und vergleicht die Rolle von 2-Komponenten-Systemen in der Osmoregulation bei Eukaryoten.