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Bonke, Rebecca (2009): Vorkommen und Expression von ß-Laktamase A und B bei Yersinia enterocolitica 4/O:3 Stämmen aus Bayern mittels Polymerase-Ketten-Reaktion und Agardiffusionstest. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die vermehrte Anwendung antimikrobieller Wirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin hat zu einer Zunahme und Selektion antibakteriell resistenter Zoonoseerreger, wie Yersinia enterocolitica geführt. Resistenzmechanismen dieser Bakterien beruhen auf der Bildung chromosomal-kodierter ß-Laktamasen (A und B). Aufgrund unterschiedlichen Vorkommens der ß-Laktamase-Gene und der Expression dieser Enzyme innerhalb der einzelnen Y. enterocolitica Biotypen weisen diese eine heterogene Antibiotikaempfindlichkeit auf. In Deutschland stehen besonders Infektionen mit Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 an erster Stelle. Obwohl dieser Bioserotyp beide chromosomalen ß-Laktamasen bildet, wurden bei Y. enterocolitica Stämmen aus Bayern eine Amoxicillin/Clavulansäure-Antibiotika-Empfindlichkeit belegt. Ziel dieser Studie war das Vorkommen der Gene und die Expression für ß-Laktamase A und B bei 200 aus Bayern isolierten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämmen mittels PCR und Agardiffusionstest zu untersuchen. Von den untersuchten Stämmen waren 60 humanen und 140 porcinen Ursprungs. Für den Nachweis der ß-Laktamase-Expression wurden im Doppelplättchenagardiffusionstest pro Stamm je zwei Müller-Hinton-Agarplatten mit einer Bakteriendichte von 107 KbE/ml beimpft und zusammen mit den zwei Antibiotikatestplättchen Ticarcillin (75 μg) und Amoxicillin/Clavulansäure (2/1 μg) bebrütet. Anschließend wurde die Expression der ß-Laktamase A und B anhand der Hemmhofgrößen um Ticarcillin und Amoxicillin/Clavulansäure bestimmt. Zur Überprüfung einer temperaturabhängigen ß-Laktamase-Expression wurde der Doppelplättchenagardiffusionstest bei den Bebrütungstemperaturen 30°C und 25°C durchgeführt. Im Anschluss wurden dieselben Stämme mittels konventioneller PCRMethode auf das Vorliegen der ß-Laktamasegene blaA und blaB überprüft. Die Auswertung der PCR Ergebnisse zeigte, dass bei 199 (99,5 %) der 200 untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämme das blaA-Gen vorlag. Von diesen 199 Stämmen zeigten 198 Stämme auch eine BlaA-Expression in der Agardiffusion. Nur ein aus Schweine-Tonsillen isolierter Stamm zeigte trotz blaA-Gen keine BlaA-Expression. Bei einem der 200 untersuchten Stämme konnte mit Hilfe der PCR kein blaA-Gen nachgewiesen werden. Trotzdem zeigte dieser aus Hackfleisch isolierte Stamm im Agardiffusionstest eine BlaA-Expression. Das blaB-Gen wurde bei allen untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämmen nachgewiesen. Im Agardiffusionstest exprimierten 3 humane und 1 porciner Stamm keine BlaB. Der Vergleich der Bebrütungs-temperaturen 30°C und 25°C zeigte einen Unterschied in der HHR-Größe um Ticarcillin. Während bei 30°C die meisten Stämme einen HHR von 3 mm aufwiesen, hatten die meisten Stämme bei 25°C einen HHR von 2 mm. Die durchgeführte Studie zeigt, dass nahezu alle (199/200) der aus Bayern isolierten und untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämme die chromosomalen Gene für blaA und blaB besitzen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass fast alle dieser Stämme beide ß-Laktamasen auch exprimieren. Die in einer vorangegangenen Studie ermittelte Empfindlichkeit dieser Stämme gegen Amoxicillin/Clavulansäure (20/10 μg) ist einerseits auf den 10fach höher konzentrierten Wirkstoff, andererseits auf eine geringere Expressionsmenge der ß-Laktamase B zurückzuführen. Die Bebrütungstemperatur zeigte keinen Einfluss auf die eigentliche ß-Laktamase-Expression, lässt aber einen Einfluss auf die Expressionsmenge vermuten.

Abstract

Detection of blaA and blaB genes and expression of ß-lactamase A and B of Yersinia enterocolitica 4/O:3 strains from Bavaria by PCR and disc diffusion methods - Emerging antimicrobial resistance has been recognised among multiple zoonotic pathogens, including Yersinia enterocolitica, due to frequent use of antimicrobial agents in veterinary and human medicine. The differences in antimicrobial susceptibility among Y. enterocolitica strains of different biotypes are largely attributed to ß-lactamase resistance, which is mediated by production of two chromosomally mediated ß-lactamases (A and B). Y. enterocolitica strains are generally resistant to ß-lactamase sensitive antimicrobials, however, some differences have been detected among different strains. Most of the Bavarian Y. enterocolitica 4/O:3 strains, which is the dominating type among human disease and pig carriers, have shown to be sensitive to amoxicillin/clavulanic acid. The aim of this work was to study the distribution of blaA and blaB genes and the expression of ß-lactamase A and B among Y. enterocolitica 4/O:3 strains isolated from human and porcine sources in Bavaria. Additionally, the influence of two different temperatures on the expression of ß-lactamase A and B was studied. Total of 200 Y. enterocolitica 4/O:3 strains, 60 from human and 140 from porcine origin, were studied. The blaA and blaB genes were detected by PCR and the expression of ß-lactamases A and B were studied by double disc diffusion method using ticarcillin (75 μg) and amoxicillin/clavulanic acid (2/1 μg) discs. Expression of ß-lactamases A and B was compared in 25 and 30°C. Most (199/200) of the strains were blaA positive and only one strain, isolated from minced meat, was blaA negative. However, this strain expressed ß-lactamase A. Only one out of 200 strains, a pig tonsil strain, did not express ß-lactamase A. All 200 strains carried the blaB gene and 196 (98,0 %) strains expressed ß-lactamase B. Three human strains and one pig tonsil strain did not produce ß-lactamase B. Expression of ß-lactamase A was slightly higher in 25°C compared to 30°C. This study shows that both blaA and blaB genes are widely distributed among Y. enterocolitica 4/O:3 strains from human and porcine origin and that most of these strains express both ß-lactamase A and B even though all these strains have shown to be sensitive to amoxicillin/clavulanic acid (20/10 μg) probably due to low amount of ß-lactamase B.