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Müller-Heidelberg, Marei (2003): Immunologisches Monitoring der Gentherapie des Fibrosarkoms der Katze: Zytokinkinetik und humorale Antwort auf Vektor und Transgen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

SUMMARY Immunological monitoring in the context of gene therapy of feline fibrosarcomas Cytokine kinetics and humoral response to vector and transgene In the context of an adenoviral gene therapy of the fibrosarcoma of the cat we introduced the human interleukin 2 (huIL 2)-gene and the feline Interferon g (feIFN g)-gene, one or the other or a combination of both. The aim of these studies is to evaluate the toxic risk and the therapeutic potential of multiple injections of two adenoviral vectors (type 5) expressing immunostimulating genes as adjuvant therapy in cats with spontaneous cancers. Several immunological parameters such as cytokine concentration, antibodies of different classes against vector and transgene and their neutralizing capacity were examined in the thesis at hand in connexion with the questions of adenoviruses in cats, pre-existing immunity and influence of inflammatory context and way of application. The kinetic of the production of IL 2 in different therapeutic approaches was evaluated. A dose-dependency was shown. The levels found in the group treated with a combination of both genes were lower than in the group treated with just AdhuIL 2. Prospects of explications are the shutdown of the viral CMV-Promoter due to the presence of interferon, the rivalry of the two transgenes to transduce a cell and the antiproliferative and antiviral effect of IFN g which directly reduces vectors and infected cells and indirectly lowers the IL 2-production by this means. More than that the application mode played an important role: The plasmic cytokine concentration was more than doubled after intratumoral injection compared to a postoperative use to the tumour’s bed. The serum peak 24 hours after vector application, which quickly redescended, is no decisive factor for the course of cytokine concentration observed locally at the tumor site. Literature shows rather a consistent local secretion for a period of nine days with intensity ten times higher than measured in blood circulation. There are indices that the serum level of IL 2 the day after the first gene transfer may be predictive for the appearance of recidivism within the first year. The tendency of infected cells in?vitro to express more IL 2 without the presence of IFN g is the same. The possibility to dose feIFN g per ELISA is presently not given. Furthermore the development of anti-huIL 2-antibodies was surveyed for a period of one year following the gene-carrying vector application. The immunoglobulins appeared early in the group of treatment with IL 2 alone (day 30), and a tardily rise of Ig G was detected in the therapeutic group with association to IFN g (day 90 to 180). By measuring the existing antibodies capable to detect or to neutralize as well the used adenovirus in ELISAs and biological assays the influence of the transgene on the antiadenoviral immune response could be proofed as well as the influence of the lieu of administration in which the vector is applied. Antiviral Ig M showed up day 14 and Ig G day 30, but their occurrence was much higher in animals treated with interferon (solitary or in association). The neutralizing capacity reached high percentages even in elevated dilutions after just one week. Moreover the immunological response to the vector depends on the application mode in terms of considerably reduced neutralizing antibodies after intratumoral injection compared to the postoperative inoculation to the tumor-surrounding tissues. The parallel-lessened defence to the transgene in this case may be assumed. Altogether the described methods are convenient to ensure an immunological monitoring of veterinary patients during an adenoviral gene therapy and to document the reactions to the applied viral vector and the expressed transgene. RESUME Surveillance immunologique du chat lors de la thérapie génique du fibrosarcome félin Cinétique des cytokines et réponse humorale contre vecteur et transgène Dans le contexte d´une thérapie génique adenovirale du fibrosarcome du chat nous avons introduit les gènes de l´interleukine 2 humaine (huIL 2) ou de l´interféron g félin (feIFN g), seuls ou en combinaison. Le but de ces études est d’évaluer le risque toxique et le potentiel thérapeutique d´injections multiples de deux vecteurs adénoviraux (type 5), contenant des gènes immunostimulateurs, comme thérapie adjuvante dans des cancers spontanés des chats. Plusieurs paramètres immunologiques comme la concentration des cytokines, des anticorps de classes différentes contre le vecteur ou le transgène et leur capacité de neutralisation ont été examinés dans la thèse présentée en rapport avec la question d´adénovirus chez le chat pour déterminer l’impact de l´immunité anti-adénovirale préexistante, l´influence d´un contexte inflammatoire et le mode d´administration. La cinétique de la production d´IL 2 dans différentes approches thérapeutiques a été évaluée. Une relation dose-réponse a été démontrée. Les niveaux trouvés dans le groupe traité avec une combinaison de deux gènes étaient plus bas que dans le groupe traité avec AdhuIL 2 seul. Ces résultats peuvent être expliqués par la coupure du promoteur viral CMV due à la présence de l´interféron dans le tissu, la compétition des deux vecteurs à transgènes différents à transduire une cellule et l´effet antiproliferatif et antiviral de l´IFN g qui limite la persistance de l’infection et engendre de ce fait une baisse de la production d´IL 2. De plus, le mode d´administration joue un rôle important: La concentration de cytokines dans le sérum a plus que doublé après une injection intratumorale, contrairement à une application postopératoire dans le lit tumoral. Le pic de concentration de cytokines dans le sérum, qui apparaît 24 heures après l´administration du vecteur et qui disparaît très vite, n´est pas un facteur décisif pour l’évolution de la concentration de cytokine observée localement au site de la tumeur. La littérature montre plutôt une sécrétion locale continue pour une période de neuf jours, avec une intensité dix fois plus élevée que celle mesurée dans la circulation sanguine. Certaines indications montrent que le niveau d´IL 2 dans le sérum, un jour après le premier transfert génétique, peut refléter les risques d’une récidive au cours de la première année. KeywordsBitte tragen Sie hLa tendance des cellules infectées in?vitro d´exprimer plus d´IL 2 sans la présence d´IFN g est la même. La possibilité de doser feIFN g par ELISA n´est actuellement pas donnée. En outre l´ apparition d´anticorps anti-huIL 2 a été surveillée pendant un an, après administration du vecteur porteur des gènes. Ces immunoglobulines se produisent tôt dans le groupe de traitement avec l’IL 2 seul (jour 30), et une hausse tardive des Ig G a été détectée dans le groupe thérapeutique avec l´association d´IFN g (jour 90 à 180). En mesurant la quantité d’anticorps capables de détecter ou de neutraliser même l´adénovirus utilisé, par des tests d´ELISA et biologiques, l´influence du transgène sur la réponse immunitaire anti-adénovirale et aussi l´influence de l´endroit de l´application dans lesquels les vecteurs sont injectés ont été démontrées. Les Ig M antiviraux se manifestaient jour 14 et les Ig G jour 30, mais étaient, en l´occurrence, beaucoup plus forte chez des animaux traités avec l´interféron (seul ou en association). La capacité de neutralisation atteint des pourcentages élevés à des dilutions importantes après une semaine de traitement. De plus, la réponse immunologique contre le vecteur dépend de la voie d´ administration: la quantité d’anticorps neutralisants est nettement réduite après injection intratumorale, contrairement à une inoculation postopératoire dans les tissus autour de la tumeur. La défense contre le transgène peut être soupçonnée d´être diminuée en parallèle. En tout, les méthodes décrites sont adéquates pour garantir une surveillance immunologique des patients vétérinaires lors d´une thérapie génique adénovirale et pour témoigner les réactions au vecteur viral appliqué et au transgène exprimé.

Abstract

Im Rahmen einer adenoviralen Gentherapie des Fibrosarkoms der Katze nutzten wir das humane Interleukin 2 (huIL 2)-Gen und das feline Interferon g (feIFN g)-Gen einzeln oder in Kombination. Das Ziel der Studien bestand darin, das Toxizitätsrisiko und das therapeutische Potential mehrfacher Injektionen von Adenoviren (Typ 5), die zur Expression immunstimulierender Gene führen, als adjuvante Therapie bei Katzen mit spontan auftretender Neoplasie zu ermitteln. Es wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene immunologische Parameter untersucht wie die Zytokinkonzentration, Antikörper unterschiedlicher Klassen gegen Vektor und Transgen und deren Neutralisationsfähigkeit im Zusammenhang mit der Frage nach dem Auftreten von Adenoviren bei Katzen, einer präexistierenden Immunität und dem Einfluss entzündlicher Verhältnisse sowie der Applikationsart. Die Kinetik der IL 2-Produktion in unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen wurde untersucht. Es zeigte sich eine Dosisabhängigkeit. Die Level, die bei Tieren gemessen wurden, die mit einer Kombination beider Gene behandelt wurden, waren niedriger als die der Tiere, die nur AdhuIL 2 erhielten. Erklärungsmöglichkeiten sind das Herunterregulieren des viralen CMV-Promoters durch das Vorhandensein von Interferon, die Konkurrenz der zwei Transgene, eine Zelle zu transduzieren, und der antiproliferative und antivirale Effekt von IFN g, der direkt zu einer Reduktion des Vektors und der infizierten Zellen führt und hierdurch indirekt die IL 2-Produktion vermindert. Außerdem spielte die Applikationsart eine wichtige Rolle: Die Zytokinkonzentration im Serum war nach intratumoraler Injektion doppelt so hoch wie nach postoperativer Anwendung im Tumorbett. Der Serumpeak 24 Stunden nach der Vektorapplikation, der schnell wieder abfiel, ist nicht der entscheidende Faktor für die Beurteilung des Verlaufes der Zytokinkonzentration, die lokal am Ort des Tumors beobachtet werden kann. In der Literatur finden sich eher Angaben über eine konstante lokale Produktion über neun Tage mit einer Intensität, die um das Zehnfache über der im Blut gemessenen liegt. Es gibt Hinweise, dass der IL 2-Serumlevel am Tag nach dem ersten Gentransfer eine Prognose für das Auftreten eines Rezidivs innerhalb des ersten Jahres ermöglicht. Es zeigt sich ebenfalls die Tendenz in?vitro-infizierter Zellen, ohne die Gegenwart von IFN g mehr IL 2 zu produzieren. Es gibt derzeit keine Möglichkeit, feIFN g per ELISA zu bestimmen. Weiterhin wurde die Entwicklung von Anti-huIL 2-Antikörpern für den Zeitraum eines Jahres nach gentransportierender Vektorapplikation überwacht. In der nur mit IL 2 behandelten Gruppe traten die Immunglobuline früh auf (Tag 30), wohingegen ein später Anstieg der Ig G in der zusätzlich mit IFN g-therapierten Gruppe beobachtet wurde (Tag 90 bis 180). Durch ELISAs und biologische Tests zur Messung der Antikörper, die fähig sind, das applizierte Adenovirus zu erkennen oder auch zu neutralisieren, konnte der Einfluss des Transgens auf die antiadenovirale Immunantwort genauso wie die Abhängigkeit vom Applikationsort, in den der Vektor injiziert wird, gezeigt werden. Antivirale Ig M treten ab Tag 14, Ig G ab Tag 30 in Erscheinung, wobei ihr Auftreten bei mit Interferon behandelten Tieren (alleinig oder in der Zytokinkombination) ausdrücklich häufiger war. Selbst in starken Serumverdünnungen erreicht die Neutralisationskapazität schon nach einer Woche sehr hohe Prozentsätze. Außerdem hängt die Immunantwort auf den Vektor ebenso von der Applikationsart ab, was sich in stark reduziertem Vorkommen neutralisierender Antikörper nach intratumoraler Injektion zeigt im Vergleich mit der postoperativen Gabe ins tumorumgebende Gewebe. Die gleichzeitig auch verminderte Abwehr gegen das Transgen darf in diesem Fall vermutet werden. Insgesamt sind die immunologischen Methoden geeignet, ein immunologisches Monitoring von veterinärmedizinischen Patienten während einer adenoviralen Gentherapie zu gewährleisten und die Reaktionen auf den applizierten viralen Vektor und das exprimierte Transgen zu dokumentieren.