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Hinkel, Rabea (2009): Kardioprotektion nach Ischämie/Reperfusion durch embryonale endotheliale Progenitorzellen: Ergebnisse aus einem präklinischen Schweinemodell. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.

Abstract

The acute myocardial infarction is still one of the major causes of death in the industrial nations. Also after reopening of the vessel, a prolonged myocardial ischemia still leads to an infarcted area. Beside the irreversible damage of the myocytes during ischemia, a so called reperfusion injury occurs, which may be reduced through an adequate therapy, at least in animal experiments. We could demonstrate before, that the retrograde application of embryonic endothelial progneitor cells, derived from murine embryos day 7.5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) is cardioprotective, mediated through paracrine factors. This reduction of the infarct size is PI3K-AKT pathway mediated. In the here presented study we investigated the influence of thymosin β4 on the eEPCs mediated cardioprotection. Methods: In vitro, neonatal rat cardiomyocytes were subjected to hypoxia (4 h) and reoxygenation (1 h), cell survival was analysed via trypan blue staining. Furthermore rat neonatal ventricular endothelial cells were subjected to hypoxia (18 h) and reoxygenation (4 h), apoptosis rate was investigated using TUNEL-staining. Embryonic EPCs with/without thymosin β4 shRNA transfection were during hypoxia and reoxygenation cocultivated, or thymosin β4 protein was added to the media. In pigs (n=9 per group) percutaneous LAD occlusion (1 h) at day 1 was performed to induce an infarction. 5x106 eEPCs with/without thymosin β4 shRNA transfection or thymosin β4 protein were applied after 55 min of ischemia through retroinfusion into the anterior interventricular vene. After 24 h of reperfusion regional and global myocardial function were analysed and infarct size was determined. In addition, the inflammation via Myeloperoxidase analysis was examined in the tissue. Results: The transfection of the short hairpin ribonucleotid acid (shRNA) led to a reduction of the messenger ribonucleotid acid (mRNA) expression of the thymosin in real time polymerase chain reaction (rt-PCR) analysis. In cell culture the survival of the neonatal cardiomyocytes was significantly increased after eEPC application, if the cells express thymosin β4. The anaysis of the TUNEL-staining displayed a considerable lower apoptosis rate of the neonatal endothelial cells, if cocultivated with eEPCs, unless thymosin β4 expression was reduced via shRNA transfection. The application of thymosin β4 protein showed similar effects to the eEPC cocultivation in both celltypes. In vivo, numerous eEPCs were detected after 24 h in the ischemic area. The number of cells was not influenced through the expression of thymosin β4. The regional application of the eEPCs significantly decreased the infarct size compared to the control group, whereas thymosin β4 shRNA transfected eEPCs blunted this effect. Once again, the retrograde application of thymison β4 protein showed a cardioprotective effect, analog to the effect of the eEPCs. The analysis of the TUNEL-positve cells displayed a clear reduction of the apoptosis rate after retroinfusion of the eEPCs or thymosin β4 protein. Once more, the eEPCs lost their cardioprotective potential when thymosin β4 shRNA was transfected. The inflammation in the ischemic area, an important marker for the value of the ischemia/reperfusion injury, was significantly reduced through the administration of the eEPCs or thymosin β4 protein. Again the reduction of the thymosin β4 expression abrogated this cardioprotective effect. These investigations show that embryonic endothelial progenitor cells reduce the ischämia/reperfusion injury at an early postischemic timepoint. The cardioprotective effect of the cells is at least partially dependent on thymosin β4, since an analog protection may be achieved by local delivery of thymosin β4 protein. In general this work shows, that beside a direct use of the progenitor cells and stem cells for the treatment of the reperfusion injury, these cells may be used to identify potential candidate proteins for cardioprotection after acute myocardial infarction and to enable a more effective treatment of the reperfusion injury in humans.