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Glas, Susanna (2003): Autoradiographische Untersuchungen zur Toxikokinetik von Myosmin in Ratten. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Autoradiographic studies on myosmine toxicokinetics in rats Myosmine, a minor tobacco alkaloid was recently detected in a wide variety of nutritional plants including cereals, nuts, cocoa and dairy products. Under acidic conditions myosmine is easily nitrosated leading to pyridyloxobutylation either directly or through the formation of N'-nitrosonornicotine (NNN). In NNN-treated rats DNA adducts releasing 4-hydroxy-(3-pyridyl)-1-butanone (HPB) are made responsible for tumours in oesophagus, oral and nasal cavities. Whereas the pharmacokinetics and metabolism of NNN have been studied in detail no such data have been available for myosmine. In the present study time-dependent distribution, binding and excretion of radiolabelled myosmine was investigated in pigmented and albino rats by quantitative whole-body autoradiography. One rat each was sacrificed by CO2 asphyxiation six and 15 minutes as well as 1, 4 and 24 hours after intravenous injection Zusammenfassung / Summary 91 of myosmine (5-3H: 1.4 µg/kg; 8.49 MBq/kg or 2’-14C: 0.27 mg/kg; 3.74 MBq/kg). Sagittal sections of 40 µm thickness obtained after deep freezing of the rats, were exposed to image plates either before or after serial extraction with solvents and water. Additionally, sections of eyes and oesophagus of untreated rats were incubated in vitro with 2’-14C myosmine. The rats killed four and 24 hours after myosmine injection were separately housed in metabolism cages for collection of urine and faeces. High concentrations of radioactivity were present six minutes after myosmine application in Harder's gland, lacrimal, salivary and accessory genital glands, nasal cavity, liver, kidney cortex, wall of the stomach fundus as well as the melanin rich parts of the eye and skin. An accumulation of radioactivity was also seen in the contents of the stomach and bladder. A similar distribution pattern was evident after 15 minutes and one hour with stronger accu-mulation in oesophagus, medulla of kidneys and accessory genital glands. An increasing labelling was observed throughout the contents of the gastrointestinal tract. Four hours after myosmine application the labelling intensity of most organs and tissues decreased conside-rably with exception of the accessory genital glands showing an extraordinary high concen-tration of radioactivity. Additionally, the oesophagus showed more marked labelling at this time. After 24 hours nearly all of the applied labelled myosmine has eliminated from the body. However, a significant labelling was still present in melanin rich tissues and in the preputial gland. The high accumulation of radioactivity in the accessory genital glands within the first four hours after myosmine injection is a new finding which has not been reported for similar compounds such as nicotine, cotinine and tobacco-specific nitrosamines. Direct determina-tion of radioactivity in the excised glands confirmed the result obtained by quantitative autoradiography. After extraction of the slices most of the radioactivity was removed from the tissues. An increased proportion of radioactivity remained in melanin rich tissues, nasal cavity, oesopha-gus, lung and liver. A distinct labelling of oesophageal mucosa as well as pigmented parts of the eyes could also be observed after in vitro incubation of slices from untreated rats. In most of the tissues, the drop of radioactivity followed a first order elimination kinetic with half lives between 0.4 hours for salivary glands and 1.2 hours for skin melanin. Within 24 hours 72 and 15 percent of the dose have been excreted in urine and faeces, respectively. The results demonstrate the suitability of saliva and hair for biomonitoring human myosmine uptake. The increased proportion of non-extractable radioactivity in the oesophagus supports our hypothesis of the possible implication of myosmine as an initiator of human oesophageal adenocarcinoma.

Abstract

Obwohl Myosmin neben Nicotin und Nornicotin zu den ersten strukturell aufgeklärten Tabak-alkaloiden zählt, wurde es bisher nur wenig erforscht. Das Vorkommen von Myosmin be-schränkt sich nicht allein auf den Tabak. In unserem Arbeitskreis gelang vor kurzem der Nachweis von Myosmin in einer Vielzahl von Lebensmitteln, beispielsweise in Reis, Weizen, Kartoffeln, Milchprodukten, Nüssen und Kakao. Myosmin wird im sauren Milieu innerhalb weniger Stunden vollständig nitrosiert. Dabei ent-steht z.T. das tabakspezifische Nitrosamin N'-Nitrosonornicotin (NNN), aber hauptsächlich eine hoch reaktive Verbindung, die an DNA bindet und mit Wasser unter Bildung von 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) abreagiert. HPB-Addukte entstehen auch nach metabolischer Aktivierung von NNN und werden für dessen krebserzeugende Wirkung in Ösophagus, Mundhöhle und Nasenraum der Ratte verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Pharmakokinetik von Myosmin bei Ratten untersucht. Hierfür wurde jeweils eine pigmentierte und eine nicht pigmentierte Ratte jeweils ein und 15 Minuten, sowie eine, vier und 24 Stunden nach intravenöser Injektion radioaktiv markierten Myosmins (5-3H: 1,4 µg/kg; 8,49 MBq/kg oder 2’-14C: 0,27 mg/kg; 3,74 MBq/kg) durch CO2-Asphyxiation getötet und umgehend tiefgefroren. Es wurden Gefrierschnitte von 40 µm Dicke in der Sagittallinie angefertigt und mit Hilfe autoradiographischer Untersuchungen qualitativ und quantitativ ausgewertet. Zur Bestimmung der Gewebebindung wurde ein Teil der Schnitte seriell mit Lösungsmitteln und Wasser extrahiert. Schnitte von Ösophagus und Auge unbehandelter Ratten wurden zusätzlich nach Inkubation mit radioaktivem Myosmin in vitro untersucht. Bei den vier und 24 Stunden nach Myosmininjektion untersuchten Ratten wurde außerdem im Stoffwechselkäfig Urin und Faezes gesammelt. Hohe Konzentrationen an Radioaktivität konnten sechs Minuten nach Applikation in der Harderschen Drüse, den Tränen-, Speichel-, und akzessorischen Geschlechtsdrüsen, den Nasenmuscheln, der Leber, den melaninhaltigen Bereichen des Auges und der Haut, aber auch in der Nierenrinde und der Drüsenmagenwand nachgewiesen werden. Die Inhalte von Magen und Blase zeigten ebenfalls eine Anreicherung von Radioaktivität. Sehr ähnlich war dieses Verteilungsmuster 15 Minuten und eine Stunde nach der Applikation. Ösophagus, Nierenmark und akzessorischen Geschlechtsdrüsen stellten sich deutlicher dar und es erfolgte eine zunehmende Verteilung der Radioaktivität über den Inhalt des Gastrointestinal-trakts. Vier Stunden nach Myosmingabe konnte eine generelle Abnahme an Radioaktivität in den meisten der vorgenannten Organe beobachtet werden, mit Ausnahme der akzessori-schen Geschlechtsdrüsen. Die Markierung der Speiseröhre trat zu diesem Zeitpunkt deut-licher in den Vordergrund. Nach 24 Stunden war der überwiegende Anteil der Radioaktivität aus dem Körper eliminiert, lediglich im Melanin und in der Präputialdrüse wurde immer noch eine deutliche Anreicherung registriert. Die hohe Akkumulation von Radioaktivität in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen, welche bis zu vier Stunden nach Myosmingabe gesehen wurde, ist ein Befund der bei Nicotin, Cotinin und tabakspezifische Nitrosaminen nicht beschrieben wurde. Er wurde durch direkte Bestimmung der Radioaktivität in diesen Drüsen nach Entnahme aus den Rattenhälften, die nicht für die Autoradiographie verwendet wurden, bestätigt. Durch Extraktion der Schnitte konnte die Radioaktivität aus den meisten Organen und Gewe-ben weitgehend entfernt werden. Gewebe mit erhöhten Anteilen an nicht extrahierbarer Aktivität waren Melanin, Nasenmuscheln, Ösophagus, Lunge und Leber. Eine Markierung der Mucosa des Ösophagus sowie der pigmentierten Bereiche des Auges konnte auch nach in vitro Inkubation von Schnitten unbehandelter Ratten deutlich gemacht werden. Die Abnahme der Radioaktivität folgte in den meisten Geweben zwischen 15 Minuten und 24 Stunden einer Kinetik erster Ordnung mit Halbwertszeiten zwischen 0,4 Stunden in den Speicheldrüsen und 1,2 Stunden im Melanin der Haut. Die Exkretion von Myosmin bzw. seiner Metaboliten über Urin und Faezes betrug innerhalb von 24 Stunden 72% und 15% der Dosis. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Speichel als auch Haare für das Biomonitoring einer Myosminbelastung des Menschen geeignet sein könnten. Der erhöhte Anteil an nicht extra-hierbarer Radioaktivität in der Speiseröhre unterstützt unsere Hypothese, dass Myosmin als Initiator einen Beitrag zur Entwicklung des Ösophagus-Adenokarzinoms beim Menschen liefern kann.