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Zipplies, Johanna (2008): Differenziell exprimierte Proteine im Serum von Pferden mit equiner rezidivierender Uveitis. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine schubweise auftretende Augenentzündung, die 10% der Pferdepopulation betrifft. Die Entzündungsschübe führen im Verlauf der Erkrankung zur Erblindung des Pferdes. Die intraokuläre Entzündung ist durch autoreaktive T-Zellen gekennzeichnet. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind weder die Ätiologie noch die Pathogenese dieser häufigen Erkrankung bislang eindeutig geklärt. Das Blut zirkuliert ständig im Körper und spiegelt dessen Zustand sehr genau wider. Deshalb stellt das Serum-/Plasmaproteom eine sehr vielversprechende Probe zur Entdeckung von Biomarkern dar, obwohl die Komplexität und enorme dynamische Bandbreite der Probe hohe Ansprüche an die Aufbereitungsmethode stellt. Die Unterschiede der Proteine im Serum bezüglich ihrer Menge, Struktur und Funktion können Hinweise auf pathologische Prozesse liefern. Ziel dieser Arbeit war es, durch quantitative Serumproteomanalyse mittels 2D-DIGE, Seren von an ERU erkrankten Pferden mit gesunden Kontrollseren zu vergleichen und differenziell exprimierte Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Die Serumproben wurden vor der zweidimensionalen Gelelektrophorese mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um einen direkten quantitativen Vergleich der Proteine zu ermöglichen. Es wurde ein Experiment mit Vollserum und ein Experiment mit depletiertem Serum mit jeweils fünf Seren von an ERU erkrankten Pferden und fünf Kontrollseren durchgeführt. Die Serumdepletion der abundanten Serumproteine erfolgte mittels polyklonaler, an Trägerkugeln gekoppelter Hühnerantikörper. Insgesamt wurden 117 differenziell exprimierte Protein-Spots gefunden, von denen 32 Spots eindeutig massenspektrometrisch (MALDI-TOF/TOF) identifiziert wurden. Die 32 identifizierten Spots repräsentieren 17 verschiedene Proteine. Sieben der Proteine, nämlich Immunglobulin G4 und 7 hc, IGLV3-25, Immunglobulin M, Komplementfaktor B, Serotransferrin und Alpha-2HS-Glykoprotein waren in den ERU Seren deutlich höher exprimiert als in den gesunden Kontrollseren. Die anderen zehn Proteine, Pigment epithelium-derived factor (PEDF), Komplementfaktor 1 und C4, Kininogen-1, Apolipoprotein H und A-IV, Immunglobulin G5 hc, Albumin, Vitamin D binding Protein und Antithrombin III waren in den Seren von an ERU erkrankten Pferden niedriger exprimiert. Einige der differenziell exprimierten Proteine stehen funktionell mit dem Immunsystem und Entzündungsprozessen in Verbindung. Alle hier identifizierten differenziell exprimierten Proteine wurden bislang noch nicht im Serum von ERU oder humaner Uveitis beschrieben und sind damit potenzielle Kandidaten, die zur Aufklärung der Pathogenese auf molekularer Ebene beitragen oder als Marker fungieren können. Darüber hinaus stimmt die verringerte Expression von PEDF im Serum mit dem Expressionsmuster des Proteins im Zielorgan der Erkrankung, dem Auge, bei an ERU erkrankten Pferden überein. Da PEDF nun in dieser Studie auch in der Peripherie der erkrankten Tiere signifikant erniedrigt gefunden wurde, ist PEDF ein vielversprechender Marker. Es bedarf weiterer Validierung, um zu prüfen, ob PEDF als diagnostischer Marker genutzt werden kann.

Abstract

Equine recurrent uveitis (ERU) is a relapsing inflammation of the inner eye, which affects up to 10% of the equine population. In the course of disease, the relapsing inflammatory attacks lead to blindness in horses. The intraocular inflammation is characterized by autoreactive T-cells. In spite of numerous studies neither the etiology, nor the pathogenesis of this frequently occurring disease are fully understood so far. Blood circulates perpetually through the body and represents its condition very precisely. Therefore the plasma-/serumproteome constitutes a promising sample for the discovery of biomarkers, although the complexity and enormous dynamic range puts high demands on the method of preparation. The differences of proteins in serum regarding their abundance, structure and function can give hints to pathological processes. The goal of this study was to compare sera of ERU-diseased horses and healthy controls, by the use of quantitative serumproteome analysis with 2D-DIGE, and to identify differentially expressed proteins by mass spectrometry. The samples were labeled with different fluorescence dyes prior to two-dimensional gelelectrophoresis to perform direct quantitative analysis of the proteins afterwards. One experiment with serum and one experiment with depleted serum were performed including five sera of ERU-diseased horses and five healthy controls each. The serum depletion of abundant proteins was accomplished by polyclonal avian antibodies immobilized on resin. Overall, 117 differentially expressed protein spots were identified. 32 of those spots could be identified unambiguously by mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF). The 32 identified spots represent 17 different proteins. Seven proteins, namely immunoglobulin G4 and 7 hc, IGLV3-25, immunoglobulin M, complementfactor B, serotransferrin, and alpha-2HS-glycoprotein were upregulated in the sera of ERU diseased horses compared to the healthy controls. The other ten proteins, pigment epithelium-derived factor (PEDF), complementfactor 1 and C4, kininogen-1, apolipoprotein H and A-IV, immunoglobulin G5 hc, albumin, vitamin D binding protein (DBP) and Antithrombin III were downregulated in the sera of ERU-diseased horses. Most of the proteins are functionally related to immune response and inflammation. All of the differentially expressed proteins identified have not been described in sera of ERU or human uveitis and can be considered as potential markers, who can contribute to elucidate the pathogenesis on molecular basis or serve as biomarkers. Furthermore is the downregulated expression of PEDF in sera consistent with the expression pattern in the target organ, the eye, in ERU-diseased horses. Since PEDF was found to be significantly downregulated in the periphery in this study it seems to be a promising marker. Further validation is needed to prove, whether PEDF can serve as diagnostic marker.