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Schönfeld, Regine Margarete (2003): Generation of Transgenic Mice to Evaluate Promoter Activity and Specificity of Two Human Endogenous Retrovirus Long Terminal Repeats = Untersuchungen zur Promotor-Aktivität und -Spezifität von zwei Long Terminal Repeats humaner endogener Retroviren in transgenen Mäusen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Generation of Transgenic Mice to Evaluate Promoter Activity and Specificity of two Human Endogenous Retrovirus Long Terminal Repeats Human Endogenous Retrovirus Long Terminal Repeats (HERV-LTRs) comprise 1.8% of the human genome (52.7 Mb). These sequences contain all the signal structures necessary for the regulation of gene transcription, such as promoters, enhancers and transcription factor binding sites. There is evidence that HERV-LTRs regulate gene expression in tissue-specific manner. This potential could be used to drive the expression of therapeutic genes, delivered by retroviral vector systems, in a safe and efficient manner. The HERV-H-H6 LTR and the HERV-L LTR were chosen for the generation of transgenic mice. Their promoter activity and specificity had prior been tested in a luciferase expression vector in vitro (Schoen et al., 2001). HERV-L was cloned into a luciferase expression vector and HERV-H-H6 was inserted into a enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vector. Transgenic mice were generated by DNAmicroinjection into pronuclei of zygotes. One pBL-HERV-L transgenic line and four pEGFP-HERV-H-H6 transgenic lines were established and analyzed. While the HERV-L promoter was not active in transgenic animals, pEGFP-HERV-H-H6 was expressed in gonads of mice of two transgenic lines. As only a single, non-expressing transgenic line was available, HERV-L promoter activity and specificity could not be evaluated. Additional transgenic lines have to be established. Expression level and pattern of the HERV-H-H6 promoter indicate specificity for gonad tissue. Whether the HERV-H-H6 promoter activity is linked to steroid production in cells remains to be clarified. Evaluating promoter activity in transgenic mice in two different expression vectors is not exclusively about the promoters, but also involves knowledge about the reporter genes. Advantages and limits of current applications of both luciferase and EGFP (with focus on the EGFP gene) are described in REVIEW OF THE LITERATURE. The conjunction of EGFP with the HERV-H-H6 promoter is to be seen critically, as all published methods for detection of EGFP in mice are described with EGFP linked to strong promoters. Problems like autofluorescence in fluorescence microscopy might be encountered when weaker promoters, such as HERV-LTRs, drive EGFP expression.

Abstract

Untersuchungen zur Promotor-Aktivität und –Spezifität von zwei Long Terminal Repeats humaner endogener Retroviren in transgenen Mäusen 1.8% des humanen Genoms bestehen aus Long Terminal Repeats Humaner Endogener Retroviren (HERV-LTRs). Solche Sequenzen enthalten alle Strukturen, die für die Regulierung von Transkription benötigt werden: Promotoren, Enhancer and Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren. Es gibt Hinweise, daß HERV-LTRs die Expression von Genen gewebespezifisch regulieren können. Eingebaut in retrovirale Genfähren, könnten HERV-LTRs therapeutische Gene sicher und effizient aktivieren. Zur Generierung transgener Mäuse wurden der HERV-H-H6 LTR und der HERV-L LTR ausgewählt. Deren Promoter Eigenschaften, wie Aktivität und Gewebespezifität, waren bereits in vitro untersucht worden (Schoen et al., 2001). Der HERV-L LTR wurde in einen Luciferase Expressionsvektor und der HERV-H-H6 LTR in einen Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Expressionsvektor kloniert. Transgene Mäuse enstanden durch DNA-Mikroinjektion in den Vorkern von Zygoten. Eine pBL-HERV-L transgene Linie und vier pEGFP-HERV-H-H6 transgene Linien wurden gezüchtet und auf Integration sowie Expression der Genkonstrukte untersucht. Während der HERV-L Promoter keine Aktivität zeigte, war Expression von pEGFP-HERV-H-H6 in Keimdrüsen von Mäusen aus zwei transgenen Linien nachweisbar. Da für das Genkonstrukt pBL-HERV-L nur eine einzige, nicht-exprimierende transgene Linie aufgebaut werden konnte, können keine Aussagen über die Aktivität und Gewebespezifität des HERV-L Promoters getroffen werden. Zu diesem Zwecke müssten weitere pBL-HERV-L transgene Linien untersucht werden. Das Expressionsmuster des pEGFP-HERV-H-H6 Genkonstruktes, weißt auf eine mögliche Gewebespezifität für Keimdrüsen hin. Eine eventuelle Verknüpfung der Aktivität des HERV-H-H6 LTRs mit der Produktion von Steroidhormonen müsste weitergehend geklärt werden.Da in dieser Arbeit zwei unterschiedliche Reportergen Systeme in der Maus angewandt wurden, sind im Literaturteil Vorteile und Einschränkungen von aktuellen Nachweisverfahren beider Reportergene, mit Schwerpunkt EGFP, in Mausgewebe zusammengefasst. Die Verbindung von EGFP mit dem HERV-H-H6 Promoter ist als kritisch zu beurteilen: Alle beschriebenen Nachweisverfahren für EGFP in der Maus gründen auf Mausmodellen, in denen das EGFP von einem starken Promoter kontrolliert wurde. Bei potenziell schwächeren Promotoren, wie HERV-LTRs, können Probleme auftreten, wie z.B. Autofluoreszenz bei der Fluoreszenzmikroskopie.