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Weinkauf, Marc Oliver (2008): Untersuchung zur Proteasomenhemmung des Mantelzelllymphoms mittels Bortezomib unter besonderer Berücksichtigung proteinanalytischer Verfahren. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das Mantelzelllymphom (MCL) ist eine neoplastische Erkrankung des blutbildenden Systems, die durch die ektopische Expression des Zellzyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1 charakterisiert ist und im Regelfall durch eine chromosomale Translokation t(11;14)(q13;q32) ausgelöst wird. Trotz stetiger Verbesserungen der Behandlungsmethoden, insbesondere der Optimierung der Kombinationstherapie und dem Einsatz der Anti-CD20-Antikörpertherapie- konnte bislang jedoch keine wesentliche Verbesserung des Gesamtüberlebens erzielt werden. Die Untersuchung der Wirksamkeit und der Wirkmechanismen neuer, molekular ausgerichteter Therapieformen hat daher bei dieser Erkrankung besonders große Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde ein 2D-PAGE-basiertes Verfahren zur Analyse der zellulären Proteinspiegel etabliert und durch die Charakterisierung der Unterschiede zwischen zwei Non-Hodgkin-Lymphom (NHL)-Subtypen (MCL und FL) auf Proteomebene validiert. Im Verlauf dieser Tests wurde darüber hinaus die Aussagekraft der 2D-PAGE-Analyse durch die Verwendung von „Proben-Pools“ verbessert, wodurch die Detektion zufallsbedingter molekularer „Bystander“-Aberrationen unterdrückt und ein repräsentativer molekularer Phänotyp charakterisiert werden konnte. Die Zahl solcher unspezifischen Proteinpunkte, die nur in einzelnen Zelllinien des Probenkollektivs nachgewiesen wurden, konnten in den „Proben-Pools“ um >66% gesenkt werden. Im Vergleich der zellulären Proteinspiegel der beiden NHL-Subtypen wiesen 175 von insgesamt 1350 Punkte auf den 2D-PAGE-Gelen Subtyp-spezifisch unterschiedliche Proteinspiegel auf, von denen 38 Punkte durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert wurden. Die identifizierten Kandidatenproteine können grob 7 funktionellen Gruppen (Apoptose / Zelltod, Reparaturmechanismen, Zellzyklus und Proliferation, Regulation der Transkription, grundlegende zelluläre Funktionen, Tumor-Antigene, unbekannte Proteinfunktion / hypothetische Proteine)zugeordnet werden und interagieren vorwiegend in einem Netzwerk um den Tumorsuppressor p53. Das Verfahren der 2D-PAGE-Analyse mit massenspektrometrischer (MS) Proteinidentifizierung wurde anschließend benutzt, um die molekulare Wirkung des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib auf MCL (Zelllinien und primäre Patientenzellen) zu analysieren. Dazu wurden 5 MCL-Zelllinien (Granta519, HBL-2, Jeko-1, NCEB-1 und Rec-1) einer Bortezomib-Konzentration von 25nM ausgesetzt und die Veränderungen der zellulären Proteinspiegel nach 1h und 4h mit denen von unbehandelten Zellen verglichen. In dieser Analyse waren die Proteinspiegel von 148 der insgesamt 1013 in allen MCL-Zelllinien nachweisbaren Proteinpunkten nach Bortezomib signifikant verändert. Durch MS konnten 38 der 41 reproduzierbar nachweisbaren Proteinpunkte identifiziert werden, wobei 20 ausschließlich in Bortezomib-sensitiven Zelllinien veränderte Spiegel aufwiesen. Eine Western Blot-Analyse von 17 der 38 identifizierten Proteine bestätigte in 76% die in 2D-PAGE-Gelen beobachteten Veränderungen der Proteinspiegel. Alle Zelllinien zeigten veränderte Spiegel von verschiedenen Hitzeschockproteinen (HSPA9, HSP7C, HSPA5, HSPD1), während Zelllinien die auf eine Behandlung mit Bortezomib ansprachen, auch veränderte Proteinspiegel bei Parametern des Energiestoff-wechsels (ATP5B, AK5, TPI1, ENO2, ENO3, ALDOC, GAPDH), der RNA- und Transkriptionsregulation (HNRPL, SFRS12) und der Zellteilung (NEBL, ACTB, SMC1A, C20orf23) sowie der Tumorsuppressoren ENO-1 und FH aufwiesen. Diese Proteine konnten in einem engen Interaktionsnetzwerk um das wichtige zelluläre „Checkpoint“-Molekül p53 gruppiert werden. Entsprechend konnten diese Ergebnisse in primären MCL-Patientenproben bestätigt werden, was die Rolle dieser Proteine im Rahmen der Proteasomeninhibition beim MCL unterstreicht.