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Hanczaruk, Matthias (2008): Die immunregulatorischen Trigger-Rezeptoren auf myeloiden Zellen (TREM) beim Haushuhn. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Einige auf myeloiden und lymphoiden Zellen bei Mensch und Maus identifizierte Rezeptorfamilien weisen sowohl aktivierende als auch inhibitorische Rezeptoren auf, die wichtige Funktionen bei der Regulation des Immunsystems haben. Die Triggering Receptors Expressed on Myeloid Cells (TREMs) stellen eine dieser immunregulatorischen Rezeptorfamilien dar und wurden beim Säuger bereits genauer untersucht. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die Mitglieder der TREMs beim Huhn eingehend charakterisiert. Der potentiell aktivierende TREM-A1 besaß eine extrazytoplasmatische Ig-Domäne und einen kurzen zytoplasmatischen Abschnitt, im transmembranen Bereich aber Lysin, als eine positiv geladene AS, die mit einem ITAM-haltigen Adaptormolekül assoziieren könnte. TREM-A1 hatte ein MR von etwa 25 kDa. Die mRNA für das membranständige TREM-A1 wurde vor allem in Makrophagen detektiert, aber auch in Gehirn, Knochenmark, Milz, Bursa und Thymus. Auf Proteinebene konnte die Expression durch einen neu hergestellten, spezifischen monoklonalen Antikörper auf Monozyten und Makrophagen, aber auch auf etwa 50% der B-Zellen und einer Subpopulation der T-Zellen nachgewiesen werden. Die mRNA der Ig-Domäne von TREM-A1 war in Thrombozyten viel höher exprimiert als die mRNA für den membranständigen Rezeptor, was einen Hinweis auf die Existenz einer löslichen Splice-Variante von TREM-A1 in diesen Zellen liefert. Mit Hilfe von Reportergenassays und löslichen Rezeptorkonstrukten konnte gezeigt werden, dass der Ligand von TREM-A1 auf stimulierten Milzleukozyten exprimiert wird, nicht jedoch auf stimulierten oder unstimulierten anderen Leukozyten. TREM-A1 wies in AS-Sequenz und Gewebeverteilung hohe Ähnlichkeit zu TREM-2 beim Säuger auf. Der inhibitorische TREM-B1 besaß zwei Ig-Domänen und einen langen zytoplasmatischen Bereich mit zwei ITIMs. TREM-B1 hatte ein MR von etwa 47 kDa und wurde mit Hilfe der qPCR vor allem auf Thrombozyten detektiert. Die ITIMs im zytoplasmatischen Anteil wurden nach Pervanadatbehandlung phosphoriliert und rekrutierten die Protein-Tyrosin-Phosphatasen SHP-1 und SHP-2. Der Ligand von TREM-B1 wurde auf mit PMA/CaIonophor stimulierten Milzleukozyten exprimiert, nicht jedoch auf mit ConA stimulierten Milzleukozyten oder auf stimulierten bzw. unstimulierten Leukozyten anderer Organe. TREM-B1 wies in AS-Sequenz und Gewebeverteilung hohe Ähnlichkeit zu TLT-1 beim Säuger auf. Vom inhibitorischen TREM-B2 existierten drei Varianten, die aber alle einen langen zytoplasmatischen Bereich mit zwei ITIMs besitzen. TREM-B2v1 besaß zwei extrazytoplasmatische Ig-Domänen, TREM-B2v2 nur eine, wobei die membran-proximale Ig-Domäne von TREM-B2v1 fehlte. TREM-B2v3 hatte die beiden Ig-Domänen von TREM-B2v1 doppelt. Die mRNA aller drei Varianten wurde vor allem in PBMC und Makrophagen exprimiert, etwas weniger hoch in Knochenmark, PBL, Milz und Caecaltonsillen.

Abstract

Some receptor families identified on myeloid and lymphoid cells in man und mouse have both inhibitory and activating receptors with important functions in the regulation of the immune system. The TREMs display one of these receptor families and were already analyzed in mammals. In the present thesis the members of the triggering receptors expressed on myeloid cells (TREMs) in chicken were closely characterized. The potential activating TREM-A1 had one extracytoplasmic Ig-domain and a short cytoplasmic tail, but a positively charged amino acid in the transmembrane region, which could associate to an ITAM-containing adaptor molecule. TREM-A1 had a relative molecular weight of about 25 kDa. The mRNA of the transmembrane TREM-A1 was mainly detected in macrophages, but also in brain, bone marrow, spleen, bursa and thymus. On protein-level the expression could be demonstrated on monocytes and macrophages by a newly produced specific monoclonal antibody, but also on about 50 % of B-cells and a subpopulation of T-cells. On thrombocytes the mRNA of the Ig-domain of TREM-A1 was expressed much higher than the mRNA of the transmembrane receptor, indicating the existence of a soluble splice variant of TREM-A1 in these cells. By reportergene assays and soluble receptor constructs could be shown, that the ligand of TREM-A1 was expressed by stimulated leukocytes from the spleen, but not by other stimulated and not stimulated leukocytes. TREM-A1 showed high similarities to TREM-2 in mammals in its amino acid sequence and gene expression pattern. The inhibitory TREM-B1 had two Ig-domains and a long cytoplasmic tail with two ITIMs. TREM-B1 had a relative molecular weight form about 47 kDa and was mainly detected in thrombocytes by qPCR. Upon pervanadate treatment the ITIMs in the cytoplasmic tail were phosphorylated and recruited the protein-tyrosine-phosphatases SHP-1 and SHP-2. The ligand of TREM-B1 was expressed on leukocytes from the spleen, stimulated with PMA/CaInonophore, but whether on leukocytes of the spleen stimulated with ConA nor on stimulated resp. not stimulated leukocytes form other organs. TREM-B1 showed high similarities to TLT-1 in mammals in its amino acid sequence and gene expression pattern. There were three variants of the inhibitory TREM-B2, all holding a long cytoplasmic tail with two ITIMs. TREM-B2v1 had two extracytoplasmic Ig-domains, TREM-B2v2 only one, which however failed the membrane-proximal Ig-domain from TREM-B2v1. TREM-B2v3 had both Ig-domains from TREM-B2v1 twice. The mRNA of all the variants was mainly expressed by PBMC and macrophages, less in bone marrow, PBL, spleen and caecal tonsils.