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Klaus, Sebastian (2003): Markerfreie transplastome Tabakpflanzen. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The genetic engineering of higher plant chloroplasts typically involves the stable integration of antibiotic resistance genes as dominant selectable markers. The potential spread of these genes through pollen release or to soil microbes via horizontal gene transfer is of considerable environmental concern. The use of chloroplast transformation alleviates the first of these problems to some degree since plastid-encoded genes are maternally inherited in most important crop species. However, the complete removal of antibiotic resistance genes from transplastomic plants is preferable for improved safety standards. In this work a new system was established for the production of marker-free chloroplast transformants using the approach of pigment mutant reconstitution in combination with a novel transformation vector. The complementation of a plastid mutant was shown to be an efficient and rapid system for the generation of plastid transformants supported by the phenotype-assisted selection and the restoration of photosynthesis. Furthermore, new results regarding the recombination process between standard transformation vectors and the plastid genome led to the idea to clone the antibiotic resistance gene outside and not between the homologous flanks used for stable gene introduction. In this configuration the selection marker can never become stably integrated into the plastome and gets simply lost once the antibiotic selection pressure is removed. Phenotype-assisted selection of plastid transformants in combination with a transient selection marker is a new efficient system for the rapid production of marker-free plastid transformants in the first generation.

Abstract

Die genetische Veränderung des plastidären Genoms höherer Pflanzen beinhaltet in der Regel die stabile Integration eines Antibiotika-Resistenzgens als dominanten Selektionsmarker. Eine mögliche Verbreitung solcher Gene über den Pollen oder in Bodenmikroorganismen über den horizontalen Gentransfer sollte aus Umweltgründen ernstgenommen werden. Die Chloroplasten-Transformation mindert das erste dieser Probleme zu einem gewissen Maße, da Plastiden-codierte Gene in der Regel nur maternal vererbt werden. Nichtsdestotrotz wäre die Entfernung von Antibiotika-Resistenzgenen aus transplastomen Nutzpflanzen für einen erhöhten Sicherheitsstandard zu bevorzugen. In dieser Arbeit wurde ein neuer Ansatz zur Herstellung markerfreier transplastomer Pflanzen etabliert. Dabei wurde die Rekonstitution einer zuvor hergestellten plastidären Mutante in Kombination mit einem neuartigen Transformationsvektor eingesetzt. Die Komplementation einer plastidären Mutante war zuvor als eine effiziente Methode zur schnellen Herstellung plastidärer Transformanten gezeigt worden, wobei die Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyp und das photosynthetische Wachstum sich als deutliche Selektionsvorteile erwiesen. Neue Erkenntnisse bezüglich der Rekombination zwischen Standard-Transformationsvektoren und dem plastidären Genom führten zu der Idee, einen neuartige Transformationsvektor herzustellen, bei dem der Antibiotika-Resistenzmarker außerhalb und nicht zwischen den homologen Flanken kloniert ist. In diesem Zustand kann der Selektionsmarker niemals stabil ins plastidäre Genom integrieren und geht verloren, sobald der Selektionsdruck entfernt wird. Die Phänotyp-unterstützte Selektion plastidärer Transformanten in Kombination mit der Verwendung eines transienten Selektionsmarkers ist ein neuer effizienter Ansatz zur schnellen Herstellung markerfreier Plastidentransformanten.