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Münsterkötter, Martin (2001): Kooperative Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und Histonen mit Promotorelementen der Phosphatasegene PHO5 und PHO8 in Saccharomyces cerevisiae. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.