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Wagner, Isabella (2008): Immunmodulatorische Wirkungen von repetitiver CpG-ODN-Gabe auf das murine Gehirn und die Leber: Inaugural-Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Unmethylierte bakterielle DNA, die reich an CG Sequenzen ist stimuliert das angeborene Immunsystem. Die Vermittlung dieser Wirkung erfolgt über den Toll-like Rezeptor 9. Reine CG Sequenzen sind im Organismus nicht stabil, da sie sehr rasch von den körpereigenen Nukleasen abgebaut werden. Mit synthetisch hergestellten Oligodeoxyribonukleotiden, sogenannten CpG-ODNs, kann eine Nukleaseresistenz erzielt werden und der immunstimulatorische Effekt nachgeahmt werden. Weiterhin wirken sich CpG-ODNs positiv auf den Verlauf von bakteriellen Infektionen, Tumoren und Prioninfektionen aus. Man weiß, dass eine Aktivierung des Immunsystems durch einmalige Gabe von CpG-ODNs nur über einen kurzen Zeitraum stattfindet. Die CpG-ODNs führen im Organismus innerhalb von Minuten zu einem mRNA Anstieg und innerhalb von Stunden zu einer kurzfristigen Zytokinsekretion und IgM Produktion, werden dann aber rasch abgebaut, so dass der immunstimulatorische Effekt in der Regel nur kurz anhält. Um CpG-ODN als Therapeutikum besser nutzen zu können liegt der Wunsch nahe, die Wirkung von CpG-ODN zu verlängern. Eine mögliche Strategie ist hierbei eine repetitive Applikation. Ziel dieser Arbeit war, den immunstimulatorischen Effekt von repetitiver CpG-ODN-Gabe besser zu verstehen und mit der Repetition die Wirkung zu verlängern. Damit könnte CpG-ODN als Therapeutikum bei bakteriellen Infektionen, Tumoren und bei Prionerkrankungen wirkungsvoll eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden jeweils 12 Gruppen zu je 5 Mäusen gebildet, wobei die jeweiligen Gruppen an 5, 7 oder 21 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils eine CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN Applikation i.p. erhielten. Die Mäuse wurden anschließend an Tag 7 oder 28 während bzw. nach der Behandlung getötet. So erhielt man folgende Gruppen: 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse 7x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 21x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse Im Verlauf der Arbeit, die die immunmodulatorische Wirkung auf das Gehirn und die Leber der Maus untersucht, konnten zusammenfassend folgende Ergebnisse herausgearbeitet werden, die mittels Real time PCR und Immunhistologie gewonnen wurden. Im Gehirn führt CpG-ODN zu einer mindestens einwöchigen Hochregulierung der mRNA von TNFα. Des Weiteren kommt es zu einer mindestens zweitägigen C1q und IFNg Hochregulierung. Eine IL-12p40 Hochregulierung findet nur ca. 18 Stunden statt, während eine STAT3 Hochregulierung nicht nachweisbar ist. In der histologischen Betrachtung finden sich in der HE Färbung keine pathologischen Veränderungen der Hirnarchitektur und in einer immunhistologischen Färbung mit CD 11b und GFAP bindenden Antikörpern keine Unterschiede zwischen den CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelten Tieren. In der Leber findet sich eine signifikante Hochregulierung von IL-12p40 über mindestens drei Wochen und eine C1q, TNFα und IFNg Hochregulierung von mindestens einer Woche. Histologisch finden sich in der HE Färbung massive Leukozyteninfiltrate über mindestens zwei Tage. In der Immunhistologie sieht man an den Infiltraten beteiligte aktivierte Makrophagen, T und B-Lymphozyten, jeweils dargestellt mit CD 11b, CD 8 und B220 bindenden Antikörpern. Es zeigte sich, dass eine repetitive CpG-ODN-Gabe eine verlängerte stimulatorische Wirkung auf das Immunsystem ausübt, was Voraussetzung für den Einsatz als Therapeutikum ist. Besonders bemerkenswert ist die Tatsache, dass man durch periphere Gabe von CpG-ODN im Gehirn eine Immunstimulierung erreichen kann. Diese könnte im Rahmen einer Therapie von Prionerkrankungen, anderen Gehirninfektionen, Morbus Alzheimer oder Gehirntumoren Anwendung finden. Allerdings sind noch weitere Studien nötig, um Risiken wie Hepatotoxizität oder Autoimmunität besser abschätzen zu können und den Mechanismus zu erforschen, wie durch periphere Gabe von CpG-ODN eine immunologische Gehirnaktivierung erreichen wird. Eine wichtige Frage für die Zukunft ist hierbei, ob die Wirkung von CpG-ODN direkt auf die Gehirnzellen wirkt oder ob es einen second messenger gibt, der die Blut-Hirn-Schranke überwindet.

Abstract

It is well known, that unmethylated bacterial DNA, which contains CG motifs has a stimulatory effect to the immune system. The recognition of this effect is mediated via the toll-like receptor 9. This immunstimulatory effect was mimicked by synthetic oligodeoxyribonucleotides (CpG-ODNs), which are much more stable in the living organism. It has been shown that CpG-ODN administration has a positive effect on infection diseases, tumors and prion infections. This study wanted to investigate whether the strategy of consecutive CpG-ODN administration could be used to induce brain relevant immune activation as prion infection predominantely effects the brain. Furthermore it was investigated whether the consecutive administration of CpG-ODN led to detrimental sideeffects in brain and liver tissue. We choose four application patterns for CpG-ODN including a saline or Neg-ODN treated control respectively. So we got 12 groups following the proximate pattern: 5x-CpG-ODN, saline or Neg-ODN treated mice, sacrificed at day 7 5x-CpG-ODN, saline or Neg-ODN treated mice, sacrificed at day 28 7x-CpG-ODN, saline or Neg-ODN treated mice, sacrificed at day 7 21x-CpG-ODN, saline or Neg-ODN-treated mice, sacrificed at day 28 We were able to detect the following results by Real-time PCR and immunohistology on the immunmodulatory effect and chronological sequence on the murine brain and the liver. In the brain mRNA TNFα levels are upregulated up to 1 week, mRNA levels of C1q und IFNg are upregulated up to at least two days. Upregulation of IL-12p40 is detectable for a minimum of 18 h. An upregulation of STAT3 was not detectable in the brain. In immunohistology we didn’t observe any pathological changes in brain morphology and no enhanced staining of microglia and astrocytes using antibodies for GFAP and CD 11b. In the liver a significant upregulation for IL-12p40 mRNA for a minimum of 3 weeks was detected. Furthermore we observed upregulated mRNA levels for C1q, TNFα and IFNg for minimum 1 week. STAT3 mRNA levels were upregulated up to two days. By HE staining we observed massive infiltrates of leukocytes for at least 2 days. In immunohistology we detected active macrophages, T-and B-Lymphozytes by the antibodies CD 11b, CD 8 and B220. Our study showed that it was possible to induce brain specific immune activation without observable side effects this may indicate the possibility to use such a strategy to combat brain diseases like prion infection, Alzheimer`s disease etc. Regarding the liver no longterm side effects were observed however further studies are needed to completely rule out relevant liver toxicity.