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Pandey, Dharmendra (2007): Signaling pathways regulating LIM-kinase-1 activation and cofilin phosphorylation in activated platelets. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

The activation of platelets is a central step during the physiological process of hemostasis and its understanding may lead us to control the pathophysiological process of intra-arterial thrombus formation and vascular occlusion, which can cause acute coronary syndrome and myocardial infarction. One of the important aspects of platelet activation is to understand the dynamic regulation and rearrangement of the cytoskeleton after stimulation. The morphological and functional changes of platelets require a drastic remodeling of the actin cytoskeleton regulated by numerous actin-binding proteins and signaling molecules such as the family of Rho-GTPases. The small GTPase Rho can regulate several aspects of cellular function, predominantly through its downstream effector Rho-kinase. One of the well established Rho-kinase-mediated signaling pathways is the phosphorylation of myosin light chain (MLC) and its counteracting MLC phosphatase. Rho-kinase regulates a second pathway that involves activation of LIM-kinases (LIMKs) and subsequent phosphorylation and inactivation of cofilin, an actin dynamizing protein. Dephosphorylation and activation of cofilin lead to severing and depolymerization of existing actin filaments. The signaling pathway Rho-kinase/LIMKs/cofilin phosphorylation during platelet activation and the question, how the phosphorylation of cofilin affects the actin dynamics underlying platelet activation, has not previously been studied. The physiological agonist thrombin and the pathophysiological relevant agonist lysophosphatidic acid (LPA), which is the main platelet-activating lipid in atherosclerotic plaque, were used as platelet stimuli to address these questions. It was found that the activation of Rho-kinase is important for an increase in F-actin content underlying Ca2+-independent platelet shape change. The activation of Rho-kinase was found to be upstream to secretion and integrin IIbβ3 activation. The rapid activation of Rho-kinase during secretion leads to a further increase in F-actin content as compared to shape change. It was observed that LPA-stimulated dense granule secretion is mainly regulated by Rho-kinase, whereas secretion induced by thrombin was only in part Rho-kinase-dependent. Together, these results show that Rho-kinase regulates the F-actin increase underlying shape change and secretion, but it is not directly involved in aggregation. This study for the first time demonstrates that platelet expresses only LIMK-1 and not LIMK-2. LIMK-1 can be activated by Rho-kinase as well as by p21-activated kinases (PAKs). Our study shows that LIMK-1 activation was mainly Rho-kinase dependent in LPA- and thrombin-stimulated platelets. Although, PAK-1/2 activation was observed during LPA-stimulated platelet shape change, PAKs are unlikely to be involved in LIMK-1 activation in these cells. Like Rho-kinase activation, it was also found that LIMK-1 activation was independent and upstream of integrin IIbβ3 activation. Surprisingly, the activation of LIMK-1 failed to increase cofilin phosphorylation during shape change induced by LPA as well as by thrombin. Inhibition of the Rho-kinase/LIMK-1 pathway unmasked cofilin dephosphorylation suggesting that during shape change the simultaneous activation of a cofilin phosphatase counteracts the effect of LIMK-1 for phosphorylating cofilin. During secretion and aggregation induced by LPA and thrombin, cofilin was rapidly dephosphorylated and subsequently rephosphorylated; the latter phase was due to Rho-kinase/LIMK-1 activation. After stimulation with LPA and thrombin under conditions, where platelet aggregation could not occur, the kinetics of cofilin de- and rephosphorylation were unperturbed indicating their independence of integrin IIbβ3 engagement. Furthermore, the results clearly showed that cofilin dephosphorylation is also independent and upstream of secretion, since the onset of cofilin dephosphorylation was as rapid as secretion in thrombin-stimulated platelets and also occurred in the absence of dense granule secretion in LPA (10 µM)-stimulated platelets. Since the kinetics of cofilin phospho-cycle was similar during secretion and platelet aggregation in LPA- and thrombin-stimulated cells, I propose a general two-step regulatory process for cofilin phospho-cycle underlying primarily secretion, and subsequently platelet aggregation: dephosphorylation by a cofilin phosphatase and then rephosphorylation by the Rho-kinase/LIMK-1 pathway. Our results showing that only dephosphorylated (activated) cofilin binds with F-actin support previous observations that the state of cofilin phosphorylation determines its association with F-actin. The effect of Y-27632 in resting platelets showing a reduction in cofilin phosphorylation, and an increase of F-actin content and cofilin association with F-actin suggested that LIMK-1-mediated cofilin phosphorylation reduces the F-actin content and cofilin association with F-actin in resting platelets. In contrast, during shape change, cofilin that showed no change in its phosphorylation was rapidly associated with the actin cytoskeleton. The maximal cofilin association with actin cytoskeleton occurred before the maximal F-actin increase, suggesting that cofilin association with F-actin might regulate the turnover and actin polymerization during platelet shape change. It is an open question, whether cofilin is locally dephosphorylated before binding to F-actin during shape change. Previous studies in other cells could correlate cofilin dephosphorylation (activation) with the depolymerization of F-actin. However, in our studies cofilin dephosphorylation during the initial phase of thrombin-induced secretion (up to 30 seconds) was associated with a large increase of F-actin and a high amount of cofilin association with F-actin. Cofilin rephosphorylation after 30 seconds did not decrease F-actin content and cofilin association with F-actin. Together, in activated platelets the association of cofilin with F-actin and the F-actin increase do not simply correlate to the cofilin phosphorylation state: it seems to be more complex. It is assumed that the cofilin phosphorylation and actin dynamics are regulated in specific compartments during platelet activation. The rapid cofilin dephosphorylation in platelets was mediated by an okadaic-acid insensitive phosphatase. The activation of the cofilin phosphatase seemed to be regulated at least in part by an increase in intracellular Ca2+ and by PI3-kinase. Cofilin de- and rephosphorylation occurring upstream of secretion and platelet aggregation suggests that the enzymes regulating the cofilin phospho-cycle could be potential targets for the development of anti-thrombotic drugs.

Abstract

Die Aktivierung von Blutplättchen spielt sowohl während der physiologischen Hämostase als auch bei pathologischen Prozessen wie der intraarteriellen Thrombenbildung und des damit verbundenen Gefäßverschlusses eine zentrale Rolle. Einer der wichtigen Aspekte der Plättchenaktivierung ist die Dynamik und Umorganisation des Zytoskelettes nach Stimulation der Thrombozyten. Die morphologischen und funktionellen Veränderungen der Plättchen erfordern eine drastische Umorganisation des Aktin-Zytoskelettes, welches durch eine Vielzahl Aktin-bindender Proteine und Signalmoleküle, wie zum Beispiel Moleküle der Familie der Rho-GTPasen, gesteuert wird. Die kleine GTPase Rho reguliert verschiedenste Zellfunktionen, hauptsächlich durch ihren nachgeschalteten Effektor Rho-Kinase. Einer der Signaltransduktionswege der Rho-Kinase verläuft über die Phosphorylierung der myosin light chain (MLC) und deren Gegenspieler der MLC-Phosphatase. Ein zweiter Signalweg involviert die Aktivierung von LIM-Kinasen (LIMK) und die nachfolgende Phosphorylierung und Inaktivierung von Cofilin, einem Aktin dynamisierendem Protein. Dephosphorylierung und Aktivierung von Cofilin resultiert in einer Spaltung und Depolymerisation von Aktinfilamenten. Es ist bisher nicht untersucht worden, ob während der Thrombozytenaktivierung der Signalweg über die Rho-kinase/LIM-kinase/Cofilin-Phosphorylierung aktiviert wird und wie die Cofilinaktivierung die Aktindynamik, welche der Plättchenaktivierung zugrunde liegt, beeinflusst. Um diese Fragestellungen zu beantworten wurde der physiologische Agonist Thrombin und der pathophysiologisch relevante Agonist Lysophosphatidsäure (LPA), welche als thrombogene Substanz in atherosklerotischen Plaques enthalten ist, als Plättchenstimuli eingesetzt und die nachfolgende Regulierung des Rho-Kinase/LIM-Kinase/Cofilin-Phosphorylierungsweges untersucht. In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Aktivierung der Rho-Kinase für einen Anstieg des F-Aktin-Gehaltes während der kalziumunabhängigen Konformationsänderung der Thrombozyten, induziert durch LPA oder Thrombin, von Bedeutung ist. Die Aktivierung der Rho-Kinase war einer Sekretion der Plättchengranula und einer Integrin αIIbβ3-Aktivierung vorgeschaltet. Die schnelle Aktivierung der Rho-Kinase führte während der Sekretion der Granulainhaltstoffe und der Thrombozytenaggregation zu einem vermehrten Anstieg des F-Aktin-Gehaltes im Vergleich zum shape change. Es konnte beobachtet werden, dass die durch LPA stimulierte Sekretion der dichten Granula in den Plättchen hauptsächlich durch Rho-Kinase reguliert wurde, während die Sekretion die durch Thrombin induziert wurde, nur teilweise Rho-Kinase abhängig war. Diese Resultate zeigen zusammen, dass Rho-Kinase den F-Aktin-Anstieg, der einer Formänderung und der Sekretion der Plättchen zu Grunde liegt, reguliert, aber nicht direkt an der Aggregation beteiligt ist. Zum ersten Mal konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass Plättchen nur LIMK-1 exprimieren und nicht LIMK-2. Erstere kann durch die Rho-Kinase sowie durch p21-aktivierte Kinasen (PAKs) aktiviert werden. Wir konnten zeigen, dass die LIMK-1 Aktivierung in stimulierten Plättchen ausschließlich von der Rho-Kinase abhängig ist. Obwohl eine PAK1/2 Aktivierung während des LPA-stimulierten shape change beobachtet werden kann, sind in LPA-stimulierten Plättchen PAKs wahrscheinlich nicht an einer LIMK-1-Aktivierung beteiligt. Es wurde gezeigt, dass die LIMK-1-Aktivierung genau wie die Rho-Kinase-Aktivierung unabhängig von der Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist und die Rho-Kinase-Aktivierung einer LIMK-1-Aktivierung vorgeschaltet ist. Überraschenderweise führte die durch Thrombin und LPA aktivierte LIMK-1 nicht zu einem Anstieg der Phosphorylierung von Cofilin während des shape change. Durch Hemmung des Rho-Kinase/LIM-Kinase Signalweges wurde eine Cofilin-Dephosphorylierung deutlich, was darauf hindeutete, dass die gleichzeitige Stimulierung von Cofilin-Phosphatasen der Wirkung einer LIMK-1 vermittelten Cofilin-Phosphorylierung entgegenwirkt. Während der LPA- und Thrombin-induzierten Plättchensekretion und Aggregation wurde Cofilin zuerst sehr schnell dephosphoryliert und anschließend, infolge der LIMK-1 Aktivierung, rephosphoryliert. Nach Stimulation mit LPA und Thrombin unter Bedingungen, unter denen keine Plättchen-aggregation auftritt, war die Cofilin-Phosphorylierung und Dephosphorylierung unverändert, was zeigt, dass Kinetik des Cofilin-Phosphorylierungszyklus unabhängig von der Integrin αIIbβ3 Einbindung ist. Weiterhin wird durch diese Ergebnisse gezeigt, dass die Cofilin-Dephosphorylierung unabhängig von der Sekretion abläuft und dieser vorgeschaltet ist, da die Dephosphorylierung von Cofilin ebenso schnell wie die Sekretion in Thrombin-stimulierten Plättchen auftrat und auch in Abwesenheit einer dichten Granula-Sekretion nachgewiesen werden konnte, wenn Plättchen ohne Fibrinogen mit LPA (10 µM) stimuliert wurden. Da die Kinetik des Cofilin Phosphorylierungszyklus ähnlich in LPA- als auch in Thrombin-stimulierten Plättchen ist, schlage ich einen generellen Zwei-Schritt Regulationsmechanismus vor: Zuerst eine Dephosphorylierung durch eine Cofilin-Phosphatase und nachfolgend eine Rephosphorylierung durch den Rho-Kinase/ LIMK-1 Signalweg. Dieser Cofilin-Phosphorylierungszyklus reguliert primär die Sekretion und sekundär die Aggregation. Unsere Beobachtungen, die zeigen, dass nur dephosphoryliertes, aktiviertes Cofilin an F-Aktin bindet, stützen vorherige Resultate, dass der Cofilin-Phosphorylierungsstatus die F-Aktin-Assoziation bestimmt. Der Effekt von Y-27632 in ruhenden Plättchen, welches eine Reduktion der Cofilin Phosphorylierung, einen F-Aktin-Anstieg und eine Steigerung in der Cofilin-Aktin-Assoziation bewirkt, lässt vermuten, dass die LIMK-1 vermittelte Cofilin-Phosphorylierung den F-Aktin Gehalt und auch die Cofilin-Aktin-Assoziation in ruhenden Plättchen reduziert. Die Situation ist anders als in aktivierten Thrombozyten: hier zeigte das Cofilin, welches keine Veränderung seiner Phosphorylierung während des Gestaltwandels von Plättchen aufwies, eine schnelle Assoziation mit F-Aktin. Die maximale Cofilin-Aktinzytoskelett-Interaktion fand vor dem maximalen F-Aktin-Anstieg statt, was auf eine Regulation des Aktin-turnover und der Aktinpolymerisation durch Cofilin während der Konformationsänderung der Thrombozyten hinweist. In bisherigen Studien an anderen Zellen wird die Dephosphorylierung von Cofilin, also dessen Aktivierung, vor allem mit einer Aktindepolymerisation in Verbindung gebracht. Hingegen konnten wir in unseren Studien belegen, dass während der Anfangsphase der Thrombin induzierten Sekretion eine Cofilindephosphorylierung mit einem enormen Anstieg des F-Aktin-Gehaltes und einer starken Cofilin-F-Aktin-Interaktion assoziiert war. Durch die Rephosphorylierung von Cofilin 30 Sekunden bis 2 min nach Stimulation zeigte sich kein Rückgang im F-Aktin-Gehalt oder in der Assoziation von Cofilin mit dem Aktin-Zytoskelett. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die Komplexität der Regulation der Cofilin-Phosphorylierung und dessen Assoziation mit F-Aktin. Die schnelle Cofilin-Dephosphorylierung in Plättchen wurde durch eine Okadaic-Säure insensitive Phosphatase katalysiert. Die Aktivierung dieser Phosphatase schien zumindest teilweise durch einen Anstieg des intrazellulären Kalziums und durch die PI3-Kinase reguliert zu sein. Die Enzyme, die den Cofilin-Phosphorylierungs-Dephosphorylierungszyklus regulieren, welcher der Sekretion der Plättchengranula und der Plättchenaggregation vorgeschaltet ist, könnten als potentielle medikamentöse Ziele für antithrombotische Medikamente dienen