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Pöplau, Petra (2007): Interaktionen zwischen löslichen Komponenten des flagellenspezifischen Typ III-Sekretionssystems von Escherichia coli K12. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal für die Erkennung durch den Exportapparat. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12 festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das Substrat FlgE näher untersucht. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH, FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR) ermittelt werden. Unter Verwendung eines bereits etablierten Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden. Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen 71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.

Abstract

External subunits of the bacterial flagellum have to be transported to their final destinations at the distal end of the growing structure. This is accomplished by the flagellar type III-secretion system (fTTSS) in Escherichia coli and other Gram-negative bacteria. FliH, FliI and FliJ are cytoplasmic components of the export apparatus within the fTTSS. The export apparatus is located in the basal body of the flagellum and provides the energy for export of the substrates like hook scaffolding protein FlgD and hook protein FlgE. These substrates must contain signals which allow recognition by the export apparatus. This work showed interactions between the soluble components FliH, FliI and FliJ of the fTTSS of E. coli K12. In addition, experiments addressing the position and nature of the recognition signal of the substrate FlgD were carried on. The substrate FlgE was also examined. A complex consisting of FliH, FliI and FliJ was prepared by affinity chromatography using the cytosolic fraction of E. coli BL21 (DE3). For this purpose, fliH-, fliI- and fliJ-gene were cloned into the vector pASK-IBA 45, expressed, and the gene products were purified. Isothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon resonance (SPR) supplied parameters concerning interactions and affinities between separately prepared FliH, FliI and FliJ. Export of the hybrid proteins FlgDPhoA and FlgEPhoA was investigated by using an established test system for fTTSS in E. coli CC181-mutants. N- or C-terminal truncated forms of FlgD but also forms of FlgD with altered nucleotide or amino acid sequences were analysed. The results indicated that an export recognition signal of the hook scaffolding protein FlgD was of proteinaceous nature and not encoded at the mRNA-level. Furthermore this export signal was located within the N-terminal 71 amino acids of FlgD, thereby the second ATG at position 52 of flgD proved unimportant for export. Full-length FlgE was transported by the fTTSS. However in contrast to FlgD, C-terminal truncated forms of FlgE impaired transport completely.