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Dudziak, Diana (2002): Regulation des Zelloberflächenmoleküls CD83 durch das Epstein-Barr Virus und Analyse seiner Funktion. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

EBV is a γ-herpes virus which is able to infect human resting B-cells and to transform them into permanently growing lymphoblastoid cell lines (LCLs). EBNA2 (Epstein-Barr virus nuclear antigen 2) is one of the first viral proteins expressed after in vitro infection and interacts with different cellular proteins like RBP-Jκ and PU.1. The EBNA2 protein acts as a transcriptional activator of the viral Latent Membrane Proteins 1 and 2 (LMP1 and LMP2) and the viral nuclear genes EBNA1, EBNA3A, -3B, -3C, EBNA-LP. Additionally EBNA2 is also able to transactivate cellular genes like CD21, CD23 or c-myc. To study the different EBNA2 target genes and the function of EBNA2 a LCL was established (ER/EB2-5 cells, Kempkes et al., 1995) harboring an estrogen-inducible EBNA2. In the presence of estrogen the ER/EBNA2 fusion protein (estrogen receptor binding domain) is located in the nucleus were EBNA2 can transactivate its target genes, whereas in the absence of estrogen the ER/EBNA2 fusion protein is kept in the cytoplasm and therefore inactive. The cells proliferate in the presence of estrogen and they arrest in the absence resulting in a phenotype similar to resting B-lymphocytes. By using the ER/EB2-5 cell line I could clearly show that the cell surface molecule CD83, belonging to the immunoglobuline superfamily (Zhou et al., 1992), is upregulated after the activation of EBNA2. By using a derivative ER/EB2-5 cell line that constitutively expressed LMP1 I could show that CD83 is still expressed even in the absence of functional EBNA2 suggesting that LMP1, the viral target gene of EBNA2, is responsible for the induction of CD83. Therefore I analysed the activation of the CD83 promoter by LMP1. LMP1 is a transmembrane protein with a short intracellular N-terminus, 6 hydrophobic transmembrane domains and a long intracellular C-terminus, containing C-terminal activator regions CTAR1, 2 and 3. The different CTAR regions are responsible for activating genes via NF-κB, ATF, AP1 and STAT signaling pathways. For the activation of its target genes LMP1 uses the same signaling molecules (TRAF, TRADD) as family members of the TNF-R family (CD40, TNF-R1, TNF-R2). The CD83 promoter was activated by LMP1 as shown by promoter luciferase reporter assays in 293-T cells. The induction was not observed in the absence of a NF-κB binding site in a CD83 promoter mutant. Furthermore LMP1 mutants which are mutated in the binding regions for TRAF2 (CTAR1) or TRADD (CTAR2) are not able to transactivate the CD83 promoter. By co-transfection of LMP1 and dominant/negative IκB the CD83 promoter could not be activated because of inactivation of NF-κB. These experiments clearly demonstrate that the CD83 promoter is transactivated by LMP1 via NF-κB. Additionally to the regulation of CD83 I was also interested in the functional role of CD83. Until now only little is known about the function of CD83. CD83 seems to have a specific role in the decision to single positive CD4+ T-cells in the thymus (Fujimoto et al., 2002). I have tested a possible co-stimulatory function of CD83 to CD4+ T-cells by retroviral expression of CD83 in non-professional antigen presenting cells (RCC). Indeed CD83 expression increased the CD4+ response in comparison to CD80 or GFP retroviral infected RCC cells. In mixed lymphocyte reactions this co-stimulatory effect could not be clearly demonstrated although a soluble CD83-Ig showed a small inhibitory influence. The identification of a CD83 ligand molecule could give new insights into the function of CD83. Therefore a CD83-Ig fusion protein as well as a CD83-tetramer construct were generated and used to screen for a potential ligand of CD83. First results showed that the CD83-Ig fusion protein and the CD83-tetramer construct bound to CD4+ and to CD8+ T-cells of isolated PBMCs as well as to activated T-cells in a culture of mixed T-cell populations.

Abstract

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert humane ruhende B-Zellen und transformiert diese in vitro zu kontinuierlich wachsenden lymphoblastoiden Zellinien (LCLs). EBNA-2 ist eines der ersten viralen Proteine, die nach Infektion exprimiert werden. Es interagiert mit zellulären Transkriptionsfaktoren wie PU.1 oder RBP-Jκ und induziert dadurch sowohl zelluläre als auch virale Gene wie LMP-1, LMP-2, EBNA-3A, -3B und -3C. Da EBNA-2 in der LCL ER/EB2-5 als Fusionsprodukt mit der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors exprimiert wird, kann die Aktivität von EBNA-2 durch Zugabe und Entzug von Östrogen in diesen Zellen reguliert werden. Nach Entzug von Östrogen werden die Zellen arretiert, was in einem Phänotyp ähnlich dem ruhender B-Zellen resultiert. Die Wiederzugabe von Östrogen induziert die Proliferation und Aktivierung der ER/EB2-5 Zellen mit Expression von Aktivierungsmarkern und Adhäsionsmolekülen wie CD21, CD23, CD39 und CD54. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die Expression des Oberflächenmoleküls CD83, eines Markers für die Reifung dendritischer Zellen und die Aktivierung von Lymphozyten, durch EBV beeinflußt wird. CD83 wird in ER/EB2-5 Zellen nur in Gegenwart von aktivem EBNA-2 (+Östrogen) auf der Oberfläche exprimiert. Es zeigte sich, daß die CD83-Expression sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene reguliert ist. Weiterhin wurde gefunden, daß CD83 nicht direkt über EBNA-2, sondern über das virale latente Membranprotein LMP-1 induziert wird. In Promotor-Reporter-Assays konnte durch Co-Transfektion von verschiedenen CD83-Promotor Luziferase-Konstrukten mit Expressionsplasmiden für LMP-1, LMP-1 Mutanten und den an der LMP-1 Signalübertragung beteiligten Proteine gezeigt werden, daß der CD83-Promotor durch LMP-1 über NF-κB reguliert wird. Der CD83-Promotor wird auch durch Mitglieder der TNF-Rezeptor Familie (CD40, TNF-R1, TNF-R2) in sehr ähnlicher Weise wie durch LMP-1 aktiviert. Über die Funktion von CD83 ist bislang sehr wenig bekannt. Aufgrund seiner Immunglobulin-ähnlichen Domäne und seines Expressionsmusters wird CD83 eine wichtige Rolle in der Antigenpräsentation und/oder den zellulären Interaktionen, die der Lymphozytenaktivierung folgen, zugesprochen. Nach retroviraler Infektion mit CD83 wurde in der nicht professionellen Antigen-präsentierenden Zellinie RCC p18.S bei der Untersuchung einer möglichen co-stimulatorischen Funktion von CD83 eine leichte Aktivierung eines spezifischen CD4+ T-Zellklons beobachtet. In einer gemischten Lymphozytenkultur konnte eine co-stimulatorische Aktivität von CD83 nicht direkt demonstriert werden, obwohl ein lösliches CD83-Ig Konstrukt eine schwache inhibitorische Wirkung zeigte. Ein Hinweis auf die Existenz von löslichen Formen von CD83 wurden auf RNA-Niveau durch Analyse alternativer Spleißprodukte gefunden. Ein weiterer wichtiger Schwerpunkt war die Identifikation einer Zellpopulation, die den Liganden von CD83 exprimiert. Mit Hilfe eines CD83-Ig Fusionsproteins und eines CD83-Tetramer-Konstrukts konnten CD83-Ligand positive Zellen sowohl auf CD4+ als auch auf CD8+ T-Zellen isolierter PBMCs sowie auf dem T-Zellklon KS festgestellt werden. Weiterhin ließ sich eine kleine Population aktivierter Granulozyten mit dem CD83-Tetramer färben. Diese Ergebnisse bieten gute Voraussetzungen für die Identifikation eines Liganden und zur Aufklärung der Funktion von CD83.