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Kalthoff, Donata (2007): Funktionelle Charakterisierung von Doppeldeletionsmutanten des Bovinen Herpesvirus Typ 1 als Basis einer neuen Markervakzineformulierung. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Ziel dieser Arbeit war es BoHV-1 Doppeldeletionsmutanten zu generieren, zu charakterisieren und bezüglich ihrer Vakzineeignung zu bewerten. Die vorgestellten Studien zur Charakterisierung eines gE und UL49.5 deletierten Virus (BoHV-1-DgEDUL49.5) konnten belegen, dass diese Deletionskombination als letal für BoHV-1 anzusehen ist. Ein UL49.5 deletiertes Virus verhielt sich dagegen funktionell wie ein Virus ohne UL49.5/gM-Komplex. Ähnlich wie bei anderen Alpha-Herpesviren war hier wahrscheinlich der zweite Umhüllungsschritt im Zytoplasma der infizierten Zelle gestört, so dass keine infektiöse Virusnachkommenschaft gebildet wurde. Ein Virus mit Deletionen der Genorte UL49 und gE (BoHV-1-DgEDUL49) zeigte hingegen fast keine Beeinträchtigungen im Hinblick auf die Replikationsfähigkeit. Dagegen war die Ausbreitungsmöglichkeit von Zelle-zu-Zelle (cell-to-cell-spread CTCS) einer solchen Mutante im Vergleich zu den entsprechenden einzel-deletierten Viren erheblich verringert. Da es sich hierbei um eine synergistische Verstärkung gegenüber den Einzelmutanten handelte, wurde geschlussfolgert, dass beide Proteine an derselben Funktionskette des CTCS beteiligt sind. Da die doppelt UL49 und gE deletierte Mutante allerdings weiterhin extrazelluläre, infektiöse Virusnachkommenschaften bildete, ist der CTCS als unabhängige Ausbreitungsform offensichtlich durch andere Funktionen bedingt als der klassische Weg der Virusausschleusung. Hinweise darauf, dass gE auch bei BoHV-1 mit pUL49 interagiert konnten dabei durch Kolokalisationsstudien im Laserscanmikroskop abgeleitet werden. Allerdings ließ keine dieser BoHV-1-Mutanten eine besondere Eignung als Vakzinestamm erkennen. Ein gE und TK doppelt deletiertes Virus zeigte hingegen in vitro kaum veränderte Wachstumseigenschaften verglichen mit dem einfach gEdeletierten Virus. Diese Deletionskombination sollte zudem gegenüber einer Virulenzsteigerung durch Rekombination mit Feldviren unempfindlicher sein, als die derzeit erhältlichen Lebendvakzinen. Zur Steigerung der immunogenen Wirkung des Lebendvirus wurde dieser neue Stamm (BoHV-1DgEDTK) in Kombination mit einem adjuvierenden, nicht viruziden, Blockpolymer eingesetzt. Dieser Ansatz wurde in einem Tierversuch an Kälbern im Vergleich zu der Immunisierung mit dem nicht adjuventierten Lebendvirus getestet. Im Ergebnis dieses Tierversuches schieden die Tiere, welche adjuventiert immunisiert wurden, weniger Virus und zudem für eine kürzere Zeit aus. Dies galt im Vergleich mit den nicht immunisierten Kontrolltieren wie auch im Vergleich mit den Tieren, die allein das Lebendvirus zur Immunisierung appliziert bekommen hatten. Auch die Quantifizierung der neutralisierenden Antikörper verdeutlichte eine gesteigerte Immunogenität der Kombination des doppelt deletierten Lebendvirus mit dem Adjuvants. Die sehr gute Immunitätslage der Tiere nach Impfung führte allerdings nach Belastungsinfektion auch zu einer zeitlich verzögerten Serokonversion im Markertest auf Basis des Nachweises von gE-spezifischen Antikörpern. Auch dies muss als Beleg für die hervorragende, immunisierende Leistung der neuen Präparation angesehen werden, da offensichtlich bei einigen der immunisierten Tiere die Virusreplikation soweit unterdrückt wird, dass keine gEspezifische Antikörperantwort mehr erfolgt. Die vorgestellte Kombination eines genetisch überattenuierten Lebendvirus und die Verstärkung der immunogenen Eigenschaften durch Zusatz eines nicht viruziden, potenten Adjuvants können die Grundlage für eine zukünftige Vakzinestratgie zur Bekämpfung der BoHV-1 oder anderer herpesviraler Infektionskrankheiten bilden.