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Rémi, Jan (2007): The circadian surface of Neuospora crassa - From physiology to molecular mechanisms. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Circadian rhythms influence almost every process in almost every organism. Understanding circadian rhythmicity is a crucial tool to understand many other biological processes. In this study Neurospora crassa, a filamentous fungus, was used to investigate the synchronization of internal time and external light-dark cycles (light entrainment). For physiology experiments a circadian surface was done, taking light-dark cycles of different lengths and varying the ratio of light to dark within each cycle. A highly systematic response could be seen: In cycles shorter than the free running period (FRP), conidiation in N. crassa entrains to dawn, in cycles with a length around the FRP conidiation entrains to midnight, and in cycles longer than the FRP conidiation entrains to dusk. This shows that N.c. entrains to light-dark cycles rather than to be driven by them. Additionally, N.c. entrains even to skeleton photoperiods with characteristics similar to other, higher, organisms. The results allowed to deduct a set of simple and highly systematic rules for entrainment to light, which can now be tested in higher organisms with less experimental effort. After entrainment on the physiology level was shown, the next step in this thesis was to investigate the mechanisms on the molecular level. Here a replication and enhancement of previous results was shown: The quick up-regulation of RNA after lights-on was repeated. Further repeating previous results, protein kinetics were shown to not be uniformly coupled to RNA-kinetics. Enhancing previous results, protein degradation seems to play an important role in entrainment, changing systematically with the varying entrainment protocols. Circadian research has been focused on the free-running period. In the future, entrainment - as an expression of the active process of zeitgeber computation by the circadian clock - will be studied more closely to understand the clock wheels of the circadian system. With this thesis it was shown that even a simple organism like Neurospora crassa entrains to light cycles rather than to be merely driven, and it entrains with characteristics that are comparable to higher organisms. This underlines the usefulness of Neurospora crassa as a model organism in circadian research, and lays the ground for entrainment research in higher organisms.

Abstract

Circadiane Rhythmen beeinflussen fast jeden biologischen Prozess in fast jedem Organismus. Das Verständnis von circadianen Rhythmen ist entscheidend um viele andere biologische Prozesse zu verstehen. In dieser Doktorarbeit wurde der Sprosspilz Neurospora crassa benutzt um die Synchronisation von innerer Uhr mit Hell-Dunkel Zyklen zu untersuchen (Licht-„Entrainment“). Durch physiologische Experimente wurde eine circadiane Oberfläche erstellt, indem die Sporulation von Neurospora crassa in Licht-Dunkel-Zyklen verschiedener Länge mit unterschiedlichen Licht-Dunkel-Verhältnissen innerhalb der einzelnen Zyklen analysiert wurde. Das Verhalten von Neurospora war sehr systematisch: In Lichtzyklen, die kürzer als der innere Tag waren, synchronisierte sich die Sporulation bei N. crassa relativ zur Morgendämmerung (Licht an), in Zyklen die in etwa der inneren Uhrlänge entsprachen synchronisierte sie sich zu Mitternacht, und in Zyklen die länger waren zur Abenddämmerung (Licht aus). Dies zeigte, dass sich N.c. aktiv mit Licht-Dunkel-Zyklen synchronisiert anstatt nur auf sie zu reagieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass N.c. sich sogar mit skelettierten Licht-Dunkel-Zyklen (Die Licht-an und die Licht-aus-Grenze wurden durch 2-stündige Lichtpulse simuliert) aktiv synchronisiert, und zwar mit einer Systematik die in höheren Organismen schon beschrieben wurde. Mit diesen Ergebnissen konnten einfache aber sehr systematische Regeln für circadiane Lichtsynchronisation erstellt werden. Diese könne nun wiederum benutzt werden, um Lichtsynchronisation in höheren Organismen zu untersuchen, bei denen die aufwendigen Experimente dieser Doktorarbeit logistisch nicht möglich sind. Nachdem die aktive Synchronisation von innerer Uhr und äußeren Zeitgebern gezeigt wurde, wurden in dieser Doktorarbeit die molekularen Mechanismen der Synchronisation von innerer und äußerer Zeit untersucht. Es konnten vorherige Ergebnisse repliziert und erweitert werden: Die schnelle Hoch-Regulierung von RNA durch das Lichtsignal wurde bestätigt, ebenso wie die vorherigen Ergebnisse unserer Gruppe, dass RNA-Kinetik und Proteinkinetik nicht linear verbunden sind. Die bekannten Mechanismen wurden erweitert, indem gezeigt wurde, dass Proteinabbau eine wichtige Rolle in der aktiven Synchronisation von innerer und äußerer Zeit spielt, da sie sich systematisch veränderte als die Lichtzyklen systematisch verändert wurden. Die circadiane Forschung hatte ihren Schwerpunkt bisher auf Versuchen in konstanten Bedingungen. In der Zukunft wird „Entrainment“ (der aktive Synchronisationsprozess von äußerer Zeitinformationen und Zustand der inneren Uhr) in den Mittelpunkt der Forschung treten, um die Arbeit der Zahnräder der inneren Uhr besser zu verstehen. Mit dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass ein einfacher Organismus wie Neurospora crassa sich aktiv mit Lichtzyklen synchronisiert anstatt nur auf sie zu reagieren, und das mit Charakteristika, die dem Verhalten von höheren Organismen entsprechen. Das zeigt den Nutzen von Neurospora crassa als Modellorganismus in der circadianen Forschung und ermöglicht systematischere “Entrainment”-Forschung in höheren Organismen.