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Zorn, Julia (2007): Charakterisierung von Antikörpern und ihrer immunsuppressiven Wirkung im präklinischen Transplantationsmodell des Hundes. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Antikörpern und ihrer immunsuppressiven Wirkung im präklinischen Hundemodell. Dazu wurde eine T-Zelldepletionsmethode mit dem caninen CD6-Antikörper MT-606 und Kaninchen-komplement zur alleinigen GvHD-Prophylaxe bei der allogenen Knochenmark-transplantation entwickelt. Zusätzlich sollten die regulatorischen Eigenschaften von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in vitro in der gemischten Lymphozytenkultur untersucht werden. Mit Hilfe des kreuzreagierenden Antikörpers MT-606, der das canine CD6-Antigen erkennt, konnte eine einfache und kostengünstige Depletionsmethode etabliert werden, welche die Fähigkeit des CD6-Antikörpers MT-606 zur Aktivierung der Komplement-kaskade ausnützt. Es wurde zunächst durch in vitro-Experimente gezeigt, dass die Methode mit MT-606 und Kaninchenkomplement eine effektive Depletion der CD6-positiven Zellen gewährleistet, wohin gegen die hämatopoetischen Stammzellen unangetastet bleiben. Die CD6-Depletion geht einher mit einer nahezu vollständigen Depletion der CD4-positiven Zellen, während die CD8-positiven Zellen nur teilweise depletiert werden. Durch drei Knochenmarktransplantationen im homo-hetero-System und zwei im DLA-identischen System wurde gezeigt, dass sich die CD6-Depletion als alleinige Methode zur GvHD-Prophylaxe eignet. Die Etablierung einer Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus wurde durch eine Hauttransplantation vom Spender auf den Empfänger bei einem Hund gezeigt. Regelmäßige Analysen des Spenderchimärismus konnten zeigen, dass die Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark eine langfristige Erholung des hämatopoetischen Systems garantiert. In mehreren in vitro-Experimenten sollte die regulatorische Fähigkeit von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in der gemischten Lymphozytenkultur (MLC) untersucht werden. Die MLC ist eine Kurzzeit-Suspensionskultur, die es erlaubt, die Reaktivität von T-Zellen eines Spenders gegen die durch Bestrahlung inaktivierten PBMCs eines anderen Spenders zu untersuchen. Die Lymphozytenproliferation oder ihre eventuelle Inhibition können durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin oder durch die Weitergabe des Farbstoffs CFSE von der Mutter- auf die Tochterzellen quantifiziert werden. Trotz Anwendung unterschiedlicher Analysesysteme konnte kein supprimierender Effekt von CD6-depletierten Knochenmarkzellen auf die Lymphozytenproliferation in der gemischten Lymphozytenkultur nachgewiesen werden. In einigen Fällen wirkten die CD6-depletierten Knochenmarkzellen sogar stimulierend auf die Proliferation der Lymphozyten. Um die generelle Anwendbarkeit des verwendeten MLC-Systems zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften einer Zellpopulation zu zeigen, wurden mesenchymale Stammzellen an Stelle von CD6-depletierten Knochenmarkzellen eingesetzt. Diese bewiesen eine hohe Potenz zur Unterdrückung der Lymphozytenproliferation in der MLC. Trotz offensichtlicher Wirkung bei der GvHD-Prophylaxe konnte ein regulatorischer Effekt von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in der MLC nicht gezeigt werden, obwohl das System durchaus zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften anderer Zellen geeignet ist. In einer zweiten Reihe von Transplantationen wurde untersucht, ob durch zusätzliche Transfusion von Spenderlymphozyten (DLT) nach der Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark im Empfänger eine GvHD induziert werden kann. Der Zeitpunkt der DLT variierte bei den einzelnen Transplantationen, es wurde aber immer eine Zelldosis von ca. 1 ∙ 108 MNCs/kg Körpergewicht transfundiert. Bei je einem Hund konnte durch DLT an den Tagen 3, 14 oder 20 eine GvHD induziert werden, deren Hauptmanifestationsort bei zwei Hunden die Leber und bei einem Hund die Haut war. Bei einer Wiederholung des Transplantationsschemas mit DLT an Tag 20 konnte bei einem weiteren Hund keine GvHD induziert werden. Offensichtlich bestand zu diesem Zeitpunkt bereits eine Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus. Das etablierte System mit Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark und DLT vor Tag 20 zur Induktion einer GvHD eignet sich hervorragend, um die Einsetzbarkeit von HSV-TK-transduzierten Zellen zur Gentherapie zu testen. Dies wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.