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Wieczorek, Lara Alexa (2002): Nervenzupfpräparation (nerve fiber teasing) in der Diagnostik peripherer Neuropathien beim Tier: Methodik und Interpretation. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

NERVE FIBER TEASING AS A DIAGNOSTIC AID IN DETECTION OF PERIPHERAL NEUROPATHIES – METHODOLOGY AND INTERPRETATION Nerve biopsies are widely used for the investigation of peripheral neuropathies in man and animals in addition to clinical and electrodiagnostic evaluation . Besides light- and electron microscopy, single nerve fiber teasing provides a convincing method in the approach of a correct diagnosis. It is the only practable method for inspection of myelinated fibers along their path. Moreover, teasing preparates are most indicative for the regenerative capabilities of myelinated fibers. Besides knowledge of pathomorphological alterations, the investigator needs some experience in identifying artefacts and autolytic changes since they can look very alike and, thus, may lead to misdiagnosis. Therefore, it was the aim of this study to provoke pure artificial and autolytic changes in peripheral nerves. For evaluating divergent fixation-protocols, 171 samples were taken to prepare about 51300 single teased fibers. Like this, phenomena of delayed fixation as well as of hyperfixation could be described. To avoid artefacts, we recommend a fixation in 2,5% glutaraldehyde for 1 to 2 hours. Minor autolytic changes could already be observed 1 to 2 hours post mortem. Interpretation became nearly impossible due to desintegration of the myelin sheath after 3 to 4 days . Those results, together with the samples of 57 selected cases (17000 single teased fibers) enabled to establish a list of phenomena seen with pathology, artefacts or autolysis. This categorization substantially increases objective diagnosis when evaluating teased fibers. Additionally, clinical signs were correlated with their neuropathological findings. In order to improve the separation of nerve fibers, the value of collagenolytic agents was investigated. About 15700 single fibers from 72 samples were slided. Teasing of samples that had already been fixed could be improved by incubation in collagenase for 1 hour. These findings proved very helpful for investigating referred biopsies which often arrive in a hyperfixed state. Collagenolytic glycin buffering is not advisable in this case, although it did facilitate the removal of the connective tissue of unfixed nerves, when samples were bathed in it. Moreover the often sparse amount of biopsied material can be the limiting factor of diagnosis. Therefore, post-teasing-light and electron microscopy is a useful approach. Even interstitial components can be visualized, and treatment allows for a correlation of suspicious regions within teased fibers with cross-section investigations. To widen the diagnostic range different methods to stain single components of teased fibers were evaluated. The thus established labelling of myelin sheathing or of the axon, respectively, by different staining protocols for the fluorochrome 5,5`-diphenyl-9-ethyl-oxacarbocyanine is helpful. This procedure for axonal investigation proved superior to whole-mount-immunohistochemical approaches as only established the paraformaldehyde fixation allowed for a selective staining of neurofilaments along the entire axon.

Abstract

In der Tiermedizin bietet die Nervenbiopsie bei der Diagnostik peripherer Neuropathien eine sinnvolle Ergänzung zu klinisch-elektrodiagnostischen Untersuchungen. Hierbei können neben Licht- und Elektronenmikroskopie insbesondere Nervenzupfpräparate einen wertvollen Beitrag leisten. Nur sie ermöglichen myelinisierte Fasern in ihrem Verlauf zu beurteilen und pathologische Veränderungen in ihrem Ausmaß entlang der Nervenfaser darzustellen. Darüberhinaus lässt sich hier die regeneratorische Kapazität myelinisierter Fasern am eindeutigsten erfassen. Voraussetzung zur Beurteilung von Nervengewebsproben ist einerseits die Kenntnis über pathomorphologische Veränderungen. Andererseits dürfen aber auch fixierungsbedingte und autolytische Phänomene nicht unterschätzt werden, da diese nicht nur die Diagnostik erschweren, sondern auch zu Fehlinterpretationen führen können. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es daher, artifizielle und autolytische Veränderungen in ihrer Reinform darzustellen. Anhand von etwa 51300 Einzelfasern aus 171 Proben konnten durch unterschiedliche Fixierprotokolle Über- und Unterfixierungsphänomene aufgezeigt werden. Übereinstimmend mit der Literatur kann für eine möglichst artefaktfreie Darstellung ein Fixiermodus von 1 bis 2 Stunden in 2,5%igem Glutaraldehyd empfohlen werden. Darüberhinaus wurde deutlich, dass autolytische Veränderungen bereits nach 1 bis 2 Stunden post mortem in geringem Maße auftreten können, und die Beurteilung von Nervenbiopsien nach 3 bis 4 Tagen aufgrund hochgradiger Myelinscheidendesintegrationen kaum mehr möglich ist. Anhand der Erkenntnisse, die innerhalb dieser Versuchsreihen gewonnen wurden, gekoppelt mit pathologischen Phänomenen, die im Rahmen einer Fallstudie an etwa 17000 Einzelfasern von 57 Proben beobachtet wurden, konnte ein Erfassungsschema erstellt werden, das eine objektive Beurteilung gezupfter Nervenfasern ermöglicht. Zudem wurden beispielhaft klinische Erscheinungsbilder einiger dieser Kasuistikfälle mit ihren neuropathologischen Befunden korreliert. Um die Trennbarkeit von Fasern bei der Herstellung von Teasingpräparaten zu verbessern, wurde der Einsatz von kollagenolytisch wirkenden Substanzen an etwa 15700 Einzelfasern von 72 Proben nach verschiedenen Protokollen untersucht. Dabei erwies sich eine 1-stündige Inkubation bereits fixierter Nerven in Kollagenase als sehr empfehlenswert. Diese Erkenntnis ist besonders hilfreich im Hinblick auf eingesandte Nervenbiopsien, die häufig überfixiert sind. Der ebenfalls kollagenolytisch wirkende Glycinpuffer kann hierzu nicht empfohlen werden. Allerdings kristallisierte sich in den Versuchsreihen heraus, dass bei unfixierten Nervenproben ein kurzes Schwenken in Glycinpuffer die Feinpräparation zur Entfernung bindegewebiger Anteile erleichtert. Mitunter kann auch die geringe Probenmenge bei Einsendungen der limitierende Faktor für die Diagnostik sein. Mit Hilfe von post-teasing-licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen kann diesem Problem jedoch erfolgreich entgegengetreten werden. Neben neuroparenchymatösen Komponenten konnten auch interstitielle Anteile dargestellt werden und eine gezielte licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung auffälliger Strukturen innerhalb der gezupften Fasern war möglich. Um die diagnostische Aussagekraft zu erweitern, wurden Verfahren zur selektiven Darstellung neuroparenchymatöser Komponenten an gezupften Einzelfasern etabliert. Mit Hilfe des Fluorochroms 5,5`-Diphenyl-9-ethyl-oxacarbocyanin war in Abhängigkeit von der Vorbehandlung sowohl eine Myelinscheiden- als auch als auch eine Axondarstellung möglich. Immunhistochemisch fand im Sinne einer whole-mount-Methode ein Antikörper gegen Neurofilamente Anwendung, wobei nur mit einer initialen Fixierung in Paraformaldehyd eine adäquate und regelmäßige Axonmarkierung entlang der Fasern zu erreichen war, so dass die fluorochromatische Axondarstellung vergleichsweise effizienter ist.