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Seebacher, Christian Florian (2002): Einzelmolekülspektroskopie von organischen Farbstoffmolekülen in porösen Festkörpern und Tieftemperaturspektroskopie an dem grün fluoreszierenden Protein. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die Anwendung der Einzelmolekülspektroskopie auf poröse Festkörper wird erstmals in dieser Arbeit beschrieben. Um diese relativ neue Methode auf die Untersuchung von Farbstoffen in porösen Festkörpern anzuwenden, wurde ein konfokales Mikroskop so umgebaut, daß es zur Detektion und Spektroskopie einzelner Moleküle einsatzfähig ist. Dafür wurden verschiedene optische Detektionssysteme aufgebaut, um alle im Fluoreszenzlicht enthaltenen Informationen zu erhalten. Mit einer Avalanche Photodiode wurde die Empfindlichkeit des Mikroskops auf die Detektion einzelner Lichtquanten gesteigert. Mit einem gepulsten Laser wurde der ZeitbereichObwohl die Einzelmolekülspektroskopie im Vordergrund der Arbeit steht, sind auch einige interessante Beobachtungen an porösen Materialien mit vielen Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) durchgeführt worden. Aufgrund des hohen dreidimensionalen Auflösungsvermögen des konfokalen Mikroskopes war es möglich, auch an nur wenige Mikrometer großen Kristallen ortsaufgelöste Untersuchungen durchzuführen. Bisher war es oft nicht möglich, zwischen Oberflächeneffekten und Eigenschaften, die in der Porenstruktur hervorgerufen werden, zu unterscheiden. Untersuchungen mit vielen Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) zeigten, daß auch scheinbar perfekte Kristalle im Inneren oft unregelmäßig aufgebaut sind. So wurde eine Methode entwickelt, um Defektstrukturen in Kristallen mit Fluoreszenzfarbstoff anzufärben und dreidimensional mit dem konfokalen Mikroskop darzustellen. Große kalzinierte MFI Kristalle besitzen Defektstrukturen, die sich im Inneren entlang der langen Kristallachse ausbreiten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß scheinbar homogen mit Farbstoff beladene Kristalle oft eine sehr ungleichmäßige Farbstoffverteilung besitzen. Auch Kristalle, die schon während der Synthese mit Farbstoff beladen werden, sind oft nicht gleichmäßig beladen. Dreidimensionale Fluoreszenzbilder von großen und regelmäßig aufgebauten AlPO4-5 Kristallen, die mit dem Farbstoff DCM beladen wurden, zeigten verschiedene geordnete und ungeordnete Strukturen. Durch die Analyse der Polarisation kann die Orientierung der Farbstoffmoleküle untersucht werden. Untersuchungen an verschieden großen Oxazin Farbstoffen, die während der Synthese in AlPO4-5 eingebaut wurden, zeigten, daß die Ausrichtung entlang der Porenrichtung mit steigender Molekülgröße abnimmt. Das kleine Oxazin 1 ist noch relativ gut orientiert, während das große Oxazin 750 ohne Vorzugsrichtung eingebaut wird. In verschiedenen M41S Materialien wurde die Diffusion von Farbstoff untersucht. Fluoreszenzbilder von M41S Monolithen zeigten das Eindiffundieren verschiedener Farbstoffe in den Festkörper. Über die zeitabhängige Analyse der Eindringtiefe konnten dadurch die Diffusionskonstanten ermittelt werden. Es zeigte sich, daß die Diffusion jeweils bei geladenen Molekülen, größeren Molekülen und bei kalziniertem Monolithen verlangsamt wird. Die Untersuchung des Diffusionsverhaltens in einer M41S Nadel zeigte eine etwa doppelt so schnelle Diffusion quer zur Nadel. Dies steht in Übereinstimmung zu elektronenmikroskopischen Bildern, die zeigen, daß die Nadeln aus zirkularen Poren besteht, die quer zur Nadelrichtung orientiert sind. Im Verlauf dieser Arbeit wurden erstmals einzelne Farbstoffmoleküle innerhalb von porösen Festkörpern detektiert. Im Vergleich zu Referenzproben, bei denen der Farbstoff in einer dünnen Polymerschicht eingebettet wird, ist das Signal zu Untergrund Verhältnis der Einzelmoleküluntersuchungen in den porösen Festkörpern etwas geringer. Auch an der Photostabilität der Fluoreszenzfarbstoffe konnte durch die Einlagerung in die Porenstrukturen keine Verbesserung beobachtet werden. Die Moleküle können nicht nur detektiert, sondern auch spektroskopiert werden. Dabei konnten durch die Analyse der Fluoreszenz verschiedene Parameter bestimmt werden, wie folgende Tabelle zeigt: der Detektion bis hinab in den Nanosekundenbereich erweitert. Durch den Einbau einer Lambda-Halbe Platte wurde die Polarisation des Laserlichtes beeinflußt, um die Orientierung eines einzelnen Moleküls zu bestimmen. Schließlich wurde durch den Einsatz eines Prismas und einer empfindlichen CCD-Kamera die spektrale Aufspaltung ermöglicht, um damit die Fluoreszenzspektren zu bestimmen. Mit allen Experimenten war es nicht nur möglich statische Eigenschaften der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe zu bestimmen, sondern auch deren dynamische Veränderungen. Eine der wichtigsten Anforderungen an organische Farbstoffmoleküle für Einzelmolekülspektroskopie ist die Photostabilität. Um geeignete Farbstoff für den Einbau in die Porenstrukturen zu erhalten, wurden die Photostabilitäten verschiedener Farbstoffe untersucht. Dazu wurden von einigen ausgewählten Farbstoffen die detektierbaren Fluoreszenzphotonen gezählt. Es stellte sich heraus, daß das Farbstoffmolekül TDI in einer dünnern PMMA Schicht eine außergewöhnlich hohe Photostabilität besitzt. Einige TDI-Molekülen emittieren sogar 10 11 Fluoreszenzphotonen bis zum irreversiblen Photobleichen. Zum anderen wurde für sehr instabile Farbstoffmoleküle eine Methode entwickelt, um durch Bleichexperimente an einem Ensemble von Molekülen mit dem konfokalen Mikroskop die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen zu ermitteln. Für den Einbau in poröse Festkörper wurden daraufhin einige Oxazinfarbstoffe und das in biologischen Untersuchungen häufig verwendete Cy5 ausgewählt. Diese Farbstoffe können im roten Spektralbereich anreget werden und besitzen mit etwa 10 7 emittierten Fluoreszenzphotonen eine relativ gute Photostabilität. Als Porenstruktur wurden besonders zwei Materialien untersucht. Die Porenstruktur AFI, die im Material AlPO4-5 vorkommt, besitzt eindimensionale Kanäle, die hexagonal wie in einer Bienenwabe angeordnet sind. Von diesem Material können auch regelmäßige Kristalle hergestellt werden, die bis zu einem Millimeter lang sind. Leider sind die Poren des AlPO4-5 mit 0,73 nm Innendurchmesser sehr eng. Alle geeigneten Fluoreszenzfarbstoffe sind etwas größer und werden daher in mehr oder weniger großen Deformationen in dem Kristall eingelagert. Größere Poren besitzen die mesoporösen M41S Materialien. In diese passen alle Farbstoffe ohne Deformation hinein. Jedoch ist die Kristallgröße der M41S Materialien auf wenige µm beschränkt. Mit der Methode der homogenen Fällung können die bisher größten hexagonal geordneten MCM-41 Kristalle hergestellt werden. Zentimeter große hexagonale M41S Festkörper (Monolithe), die durch eine Synthese mit einem Flüssigkristall hergestellt werden, verlieren, wie hier gezeigt wird, während der Synthese ihre eindimensionale Ausrichtung der Poren.Beobachtete Eigenschaft des Lichtes Information aus statischen Bestimmungen Information aus zeitabhängigen Bestimmungen Intensität immer Notwendig Raten (Singulett, Triplett, etc.) Ort Position Diffusion, Transport Polarisation Orientierung Drehung, Rotation Energie Fluoreszenzspektren spektrale Diffusion Diese verschiedenen Untersuchungsmöglichkeiten wurden aufgebaut und an einer Referenzprobe (TDI in PMMA) getestet. Für die Datenanalyse konnte zum Teil auf Methoden in der Literatur zurückgegriffen werden. Es wurde darauf geachtet, daß immer eine Fehlerabschätzung oder eine Simulation durchgeführt wurde, damit die Ergebnisse sinnvoll interpretiert werden konnten. Oft konnten schon an der Referenzprobe (TDI in PMMA) sehr interessante Ergebnisse erhalten werden. So wurden z.B. neben der extrem hohen Photostabilität zwei verschiedene Populationen der Triplettlebensdauer gemessen. Die Position eines einzelnen TDI Moleküls konnte durch die Detektion vieler Photonen auf besser als 1 nm bestimmt werden. Die Analyse von zeitabhängigen Orientierungswinkeln deutet darauf hin, daß ein TDI Molekül in PMMA noch eine sehr geringe Wackelbewegung (~1°) ausführen kann. Bei der Analyse mehrerer 10000 Fluoreszenzspektren von einem TDI Molekül konnten spontane Änderungen der Fluoreszenzwellenlänge und der Schwingungskopplung beobachtet werden. Obwohl die Messungen in den Porenstrukturen aufgrund der geringeren Photostabilität nicht so präzise Ergebnisse liefern, konnten auch hier interessante Beobachtungen gemacht werden. Durch die Analyse der Orientierungswinkel vieler individueller Farbstoffmoleküle konnte gezeigt werden, daß die einzelnen Oxazinfarbstoffe in AlPO4-5 eine gaußförmige Verteilungsfunktion bezüglich ihres Tiltwinkels zur Porenrichtung aufweisen. Die zuvor erwähnten Messungen an einem Ensemble von Molekülen können die Form der Verteilungsfunktion nicht bestimmen. Aufgrund der Kenntnis einer gaußförmige Verteilungsfunktion kann auf ein statistisches Einbauverhalten der Farbstoffmoleküle in Defektstrukturen während der Synthese geschlossen werden. Auch in einem MCM-41 Kristall, dessen große Poren jeden beliebigen Einbauwinkel des Farbstoffes Cy5 erlauben würden, wird eine bevorzugte Orientierung beobachtet. Der Orientierungswinkel zur Porenrichtung zeigt auch hier eine gaußförmige Verteilungsfunktion. Interessanterweise wird bei der frontalen Ansicht auf die hexagonale Struktur (entlang der Bienenwabenstruktur) eine bevorzugte Orientierung auf die Flächen des Sechsecks beobachtet. Eine Ensemblemessung kann unmöglich diese bevorzugte Orientierung detektieren. Neben diesem statischen Verhalten zeigen einige wenige Moleküle auch eine Änderung der Molekülorientierung. Zwei individuelle Oxazin 1 Moleküle änderten ihre Orientierung in AlPO4-5 während der Messung spontan. Im Vergleich zu den anderen Oxazin 1 Molekülen besaßen diese beiden einen ungewöhnlich großen Orientierungswinkel gegen die Porenrichtung. Vermutlich wird die Bewegung durch einen größeren Defekt der Porenstruktur ermöglicht. Ein TDI Molekül im Inneren eines M41S Monolithen zeigte sogar eine mehrfache Drehung zwischen 3 verschiedenen Orientierungen.Eine Dynamik bezüglich des Ortes zeigten einzelne TDI Moleküle im M41S Monolith. Aufgrund der starken hydrophoben Eigenschaften des TDI kann davon ausgegangen werden, daß sich der Farbstoff immer noch im Inneren der Mizelle des Flüssigkristalls befindet, aus dem der Festkörper synthetisiert wurde. Die Diffusionsbewegung kann durch eine Serie von Fluoreszenzbilden mit dem konfokalen Mikroskop direkt verfolgt werden. Entgegen der erwarteten eindimensionalen Diffusion, die die hexagonale Struktur des Monolithen eigentlich erwarten läßt, wird eine isotrope Diffusion ohne Vorzugsrichtung beobachtet (D ~ 0,04 µm 2 /s). Im reinen Flüssigkristall dagegen ist die eindimensionale Diffusion vorhanden. Vermutlich werden die eindimensionalen Poren bei der Synthese der festen Silikatwand so stark verknäult, daß auf der beobachteten Längenskala ein Festkörper ohne Vorzugsrichtung entsteht. Auch die viel langsamere Diffusion im Vergleich zum reinen Flüssigkristall (D ~ 2 µm 2 /s) kann über diese Verknäulung der Poren erklärt werden. Schließlich wurden noch Messungen durchgeführt, um simultane Änderungen der Orientierung, Fluoreszenzspektren oder Triplettraten an einem einzelnen Farbstoffmolekül zu beobachten. Besonders die gleichzeitige Detektion von Fluoreszenzspektren und der Orientierung lassen sich experimentell gut durchführen. Zur Interpretation der Ergebnisse muß hier zwischen einer starken und einer schwachen Kopplung zwischen Gast und Wirt unterschieden werden. Bei einer polaren Probe wird eine starke Wechselwirkung zwischen Gast und Wirt erwartet. Diese müßte dazu führen, daß sich Änderungen in der Orientierung auch in geänderten Fluoreszenzspektren und umgekehrt bemerkbar machen. Bei einem geladenen Molekül wie Oxazin 1 wird solch eine starke Kopplung des elektronischen Systems an die polare AlPO4-5 Umgebung erwartet. Eine starke Änderung des Fluoreszenzspektrums könnte daher von einer Umorientierung des Farbstoffes herrühren. Bei den durchgeführten gleichzeitigen Messungen konnte aber nur spektrale Diffusion (±1-20 nm), aber keine gleichzeitige signifikante Umorientierung (>3°) beobachtet werden. Eine Erklärung für dieses Verhalten könnte die Bewegung des Gegenions des Farbstoffmoleküls sein, dessen Lage einen großen Einfluß auf die Fluoreszenzeichenschaften hat. Eine Umorientierung mit gleichzeitiger Detektion der Fluoreszenzspektren konnte jedoch nicht gemessen werden. Beide Ereignisse, Umorientierungen und spektrale Änderungen, konnten an TDI im M41S Monolith detektiert werden. Dabei zeigte sich aber, daß es sich hier um zwei unabhängige Prozesse handelt. Deutliche spektrale Sprünge (> 3 nm) korrelieren nicht mit deutlichen Umorientierungen (~60°). Eine geometrische Änderung des Farbstoffmoleküls oder der näheren Umgebung scheidet daher als Ursache für die spektrale Diffusion aus. Da hier aber eine schwache Wechselwirkung zwischen dem unpolaren TDI und der unpolaren Tensidumgebung vorliegt, werden auch keine starke Änderungen der Fluoreszenzspektren während der Umorientierung erwartet. Die spektrale Diffusion wird hier vermutlich von kleinen diffundierenden Teilchen (z.B. O2 oder Ionen) verursacht, die sich unabhängig von den Farbstoffmolekül bewegen können. Die Methode der Einzelmolekülspektroskopie liefert neue Einblicke in poröse Festkörper. Besonders durch die zeitabhängigen Untersuchungen können Informationen erhalten werden, die zuvor unter dem Mittelwert verborgen blieben. Ein kleiner Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Tieftemperaturfluoreszenz-spektroskopie an dem grün fluoreszierendem Protein (GFP). Dafür wurden der Wildtyp und verschiedene Varianten mit Mutationen in der Umgebung des zentralen Chromophors bei 2 K untersucht. Im Vergleich zur Raumtemperatur zeigten die Spektren bei tiefen Temperaturen deutlich mehr Struktur. Dadurch konnten verschiedene Sub-Zustände in den Varianten identifiziert werden. Bei fast allen Varianten konnten durch intensive Bestrahlung langwellig absorbierende Photoprodukte erzeugt werden, die erst bei etwa 50 bis 100 K wieder zerfallen. Obwohl eine relativ starke Elektron-Phonon-Kopplung beobachtet wird, ist an einigen ausgewählten Stellen auch hochaufgelöste Tieftemperaturspektroskopie wie spektrales Lochbrennen und Fluoreszenzlinienverschmälerung möglich. Durch Temperatur-Ableitungs-Spektroskopie werden an Wildtyp-GFP die Energien und Verteilungsfunktionen der Zerfallsbarrieren der metastabilen Photoprodukte bestimmt. Schließlich wurde durch temperaturabhängige Kurzzeitspektroskopie an Wildtyp-GFP der 'Excited state proton transfer' (ESPT) charakterisiert. Für diesen wird bis etwa 50 K eine thermische Barriere nach Arrhenius mit einer Aktivierungsenergie von ~2,3 kJ/mol gefunden. Unterhalb von etwa 50 K dominiert vermutlich ein Tunnelprozeß.