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Babel, Brenda (2007): Investigations on bone metabolism in intact and ovariohysterectomised miniature pigs. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Biochemical markers of bone metabolism have become a common form of analysis for bone metabolism. A number of factors, however, cause fluctuations in these parameters such as day-to-day changes, seasonal changes and age. In women, studies have confirmed parameter fluctuations during the menstrual cycle (Zittermann et al., 2000). Up until now, the coherence hormone status and bone marker activity have been scanty in animal models. The objective of this study was to examine the dependence of bone marker activity on the estrous cycle in the Dresdner miniature pig. The present study included the bone formation marker osteocalcin, and bone resorption marker serum crosslaps. The estrous cycle dependency was determined by comparing the development of marker concentrations with progesterone and estradiol in the respective cycle stages of each pig after synchronisation and at particular sampling points of time. Furthermore the behaviour of biochemical markers, osteocalcin and crosslaps were examined at and after ovariohysterectomy (OVX) to determine the effect of OVX on these specific bone markers. Another aspect of this study was to determine the influence of calcium content in the diet on bone metabolism before and after castration. Sixteen animals were divided into three groups, two control groups and a OVX group. One control group received a 0.99% calcium diet, while the OVX and the second control group received a 0.7% calcium diet. The animals in the OVX group were ovariohysterectomised, while the pigs in the control and the second control groups were not manipulated. The trial consisted of two periods; the pre-castration period, lasting 65 weeks and a post-castration period lasting 8 weeks. Blood samples were drawn and analysed at selected extraction times. The bone marker development pre-castration showed age-related and cycle-related changes. Osteocalcin showed definite increased concentrations, at the age of 9-13 months. If 10 months were seen as a late prepubal stage (Tanner stage) in the minipig, osteocalcin reacts more slowly in minipigs as it does in humans. Assuming that female minipigs in the present study can be compared with female humans during puberty, the present study shows that osteocalcin concentrations are still high at late puberty, unlike those in humans, which are high at midpuberty. Crosslaps increased up until the age of 10 months and then showed a constant decrease in concentrations. This would be the equivalent reaction of resorption markers in humans. Osteocalcin concentrations increased with an increase in estradiol concentrations, so estradiol stimulates bone formation in miniature pigs. The resorption marker serum crosslaps also showed cyclic fluctuations. High crosslaps concentrations were found in the estrus cycle stage or late follicular cycle stage; whereas low crosslaps were found in the luteal phase. As was often the case in other studies, the effect of a calcium reduced diet was not evident between the control and second control group. Resorption and formation markers showed changes post-castration in the OVX group, which shows that this is a calcium diet that can be used in further studies where induced osteopenia is required. Osteocalcin showed a definite concentration increase 4 weeks after castration. Serum crosslaps increased 2 weeks post operation. These increased concentrations were not significant, which could be due to the small animal numbers included in this study. Both markers reacted within a short time after ovariohysterectomy, which is a useful aspect for further osteoporosis research. This study portrayed the usefulness of the minipig as an animal model, not only for further studies on postmenopausal osteoporosis, but also verified the use of osteocalcin and serum crosslaps as biochemical parameters of bone metabolism in this species, to have age-related and cycle-related fluctuations, which should be considered in further studies.

Abstract

Die Bestimmung von biochemischen Markern des Knochenstoffwechsels stellt bei der Analyse des Knochenstoffwechsels eine weit verbreitete Methode dar. Eine Reihe von Faktoren, wie Tageszeit, Jahreszeit und Alter, beeinflussen dabei diese Parameter. Bei Frauen konnte eine Abhängigkeit vom Menstruationszyklus nachgewiesen werden (Zittermann et al., 2000). Eine Beeinflussung der Knochenmarkeraktivität durch den Hormonstatus wurde für die verschiedenen Tiermodelle noch nicht ausreichend untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung der Zyklusabhängigkeit der Knochenmarkeraktivität an Dresdener Miniaturschweinen. Als Marker für die Knochenformation wurde Osteocalcin und als Marker für die Resorption wurden Crosslaps im Serum bestimmt. Die Zyklusabhängigkeit wurde durch den Vergleich der Veränderungen der Markerkonzentrationen mit der Progesteron- und Östradiolkonzentration, im zeitgleich gewonnenen Serum an unterschiedlichen Zyklustadien im Anschluss eine Zyklussynchronisation, bestimmt. Zusätzlich wurden Veränderungen der Konzentrationen von Osteocalcin und Crosslaps im Zeitraum nach Ovariohysterektomie (OVX), zur Ermittlung des Einflusses einer Ovariohysterektomie auf die Höhe der Knochenmarker, untersucht. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Untersuchung der Auswirkung unterschiedlicher Calciumgehalte der Futterrationen auf den Knochenstoffwechsel vor und nach der Kastration. Sechzehn Tiere wurden in drei Gruppen, zwei Kontrollgruppen und eine OVX Gruppe aufgeteilt. Eine Kontrollgruppe wurde mit einer Futterration die 0.99% Kalzium enthielt, gefüttert, während der zweiten Kontrollgruppe und die OVX Gruppe eine Futterration mit einem Kalziumgehalt von 0.7% erhielten. Die Tiere der OVX Gruppe wurden ovariohysterektomiert, während die Tiere der beiden Kontrollgruppen keinem Eingriff unterzogen wurden. Die Untersuchungen wurden getrennt nach der Vorkastrationsperiode, die einen Zeitraum von 65 Wochen umfasste, und der Nachkastrationsperiode, die einen Zeitraum von 8 Wochen umfasste, ausgewertet. An bestimmten Zeitpunkten wurden Blutproben gewonnen und analysiert. Die Knochenmarkerkonzentrationen zeigten während der Vorkastrationsperiode eine Alters- und Zyklusabhängigkeit. Die Osteocalcinkonzentration steigt bis zu einem Alter von 9-13 Monaten. Wenn eine Alter von 10 Monaten als spätes präpubertales Stadium (Tanner stage) des Miniaturschweines angesehen wird, scheinen sich die Osteocalcinkonzentrationen beim Miniaturschwein langsamer zu verändern als es beim Menschen beschrieben ist. Die Miniaturschweine in dieser Untersuchung können in ihrem Entwicklungstand mit Mädchen während der Pubertät verglichen werden. Unter dieser Annahme kann man davon ausgehen, dass die Konzentrationen von Osteocalcin beim Miniaturschwein, in der Spätpubertät noch hoch sind, während sie beim Menschen in der Mitte der Pubertät am höchsten sind und dann abfallen. Die Crosslapskonzentration im Serum nimmt bis zum Alter von 10 Monaten zu, im Weiteren konnte dann aber ein konstanter Abfall der Konzentration nachgewiesen werden. Diese Konzentrationsentwicklung entspricht der die beim Menschen beschrieben ist. Die Osteocalcinkonzentration nimmt mit ansteigender Östradiolkonzentration zu, dies lässt darauf schließen, dass Östradiol die Knochenformation stimuliert. Die Knochenmarker Crosslaps zeigten ebenfalls zyklusabhängige Konzentrations-veränderungen. Hohe Crosslapskonzentrationen konnten im Östrus oder im Proöstrus nachgewiesen werden, während in der Lutealphase niedrige Crosslapskonzentrationen im Serum festgestellt werden konnten. Wie schon in anderen Studien beschrieben, konnten keine Effekte einer kalziumreduzierten Futterration zwischen den beiden Kontrollgruppen festgestellt werden. Resorptions- und Formationsmarker reagieren in der Postkastrationsperiode in der OVX Gruppe sensitive. Dies zeigt, dass die gefütterte Ration mit einem Kalziumgehalt von 0.7% in Versuchen zur Erzeugung einer Osteoporose in Miniaturschweinen als Futterration geeignet erscheint. Die Osteocalcinkonzentration stieg in der vierten Woche nach der Kastration an. Die Serum Crosslapskonzentration stieg zwei Wochen nach der Kastration an. Diese Anstiege waren nicht signifikant, was mit der kleine Tierzahl in der vorliegenden Arbeit zusammenhängen könnte. Beide Marker reagierten in einem sehr kleinen Zeitabschnitt nach der Ovariohysterektomie, was für die Osteoporoseforschung sehr nützlich sein kann. Die vorliegende Arbeit zeigt auf, dass das Miniaturschwein ein geeignetes Modell zur postmenopausalen Osteoporoseforschung darstellt. Die Osteoclacin und Crosslapskonzentration als Marker für den Knochenstoffwechsel folgt bei dieser Spezies einem alters- und zyklusabhängigen Verlauf. Dies muss bei weiterführenden Studien berücksichtigt werden.