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Völzke, Matthias (2007): Verkürzung und Optimierung des Nachweises von Listeria monocytogenes in Milcherzeugnissen mittels Real-Time-PCR. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Real-Time PCR-Verfahren auf Basis des TaqMan-Systems für die Detektion von Listeria spp. und von Listeria monocytogenes entwickelt und hinsichtlich der Anwendbarkeit für den Nachweis von Listerien in Milcherzeugnissen und Umfeldproben überprüft. Der genusspezifische Nachweis für Listeria spp. erfasst mit Listeria monocytogenes, Listeria innocua und Listeria seeligeri die wichtigsten und am häufigsten in Milchprodukten nachgewiesenen Listerienspezies. Wenn im gleichen Nachweissystem anstelle der fluoreszenzmarkierten TaqMan-Sonde der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff SybrGreen verwendet wird, kann das gesamte Genus Listeria, mit Ausnahme von Listeria grayi ssp. grayi, nachgewiesen werden. Der speziesspezifische Nachweis für Listeria monocytogenes erfasst alle getesteten Stämme dieser Spezies (n = 34) und reagierte mit keiner anderen Spezies falsch positiv. Bei der Untersuchung von Reinkulturen waren für beide Nachweissysteme Keimzahlen von 104-105 KbE/ml für einen sicheren Nachweis erforderlich. Nach der erfolgreichen Etablierung der Nachweise für Reinkulturen wurden künstlich kontaminierte Milchprodukte untersucht. Es wurden sowohl unproblematische Matrizes wie pasteurisierte Vollmilch als auch Produkte mit einem hohen Gehalt an Begleitflora wie Weichkäse untersucht. Hierbei waren für einen zuverlässigen Nachweis niedriger Listerienzahlen von 1-10 KbE/g, aufgrund inhibitorischer Einflüsse einiger Probenmatrizes sowie der Begleitflora auf das Listerienwachstum, Anreicherungszeiten in Halb-Fraser von bis zu 48 h erforderlich. Eine negative Beeinflussung der PCR-Nachweise durch Probenbestandteile wurde nicht beobachtet, wenn die Proben mit dem PrepMan Ultra™ Reagenz aufbereitet wurden. Eine deutliche Verkürzung der Nachweiszeit in problematischen Probenmatrizes konnte durch Separation der Listerien aus der selektiven Anreicherungskultur mittels paramagnetischer Partikel, die mit listerienbindenden Proteinen aus Listeria-spezifischen Phagen beschichtet sind (CBD-MS; KRETZER, 2006), erreicht werden. Die separierten Listerien wurden nach einem kurzen nicht selektiven Anreicherungsschritt (3 h in Trypton-Soja- Bouillon mit Hefeextrakt) mit dem PrepMan Ultra Reagenz aufbereitet und in der PCR eingesetzt. Mit dieser Methode konnte die selektive Anreicherung auf 20 h und die Gesamtnachweiszeit auf 29 h reduziert werden.