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Fux, Robert Günther (2007): Entwicklung und Prüfung von Verfahren zum Nachweis des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe in getrockneten Ohrgewebeproben mittels Antigen-ELISA und real time RT-PCR. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Early detection and elimination of cattle persistently infected (PI) with bovine viral diarrhoea virus (BVDV) is a key element for eradication programs. Testing dried skin biopsies derived from ear tagging might be useful for detection of BVDV in newborn calves. The aims of this study were the development of methods for antigen solubilization and RNA preparation, the investigation of the stability of these viral components and the comparison of the analytical sensitivity of different tests. Commercial antigen capture ELISAs for NS3, Erns and mixed antigens, a blocking ELISA for BVDV antibodies and two real time RT-PCR assays for 5’UTR were used as BVDV specific tests. Ear biopsies were collected from nine BVDV antibody free PI animals (infected with BVDV-I CR4043) after slaughter and from twelve PI calves (fetal infection with BVDV-I PT810) after euthanasia at the age of 5-13 days in the time of colostral antibodies. For solubilization of the BVDV antigens the detergents dodecyl sulfate, sodium deoxycholate and EMPIGEN were inappropriate. Out of the suitable detergents (CHAPS, Triton X100, Nonidet P-40, Tween 20, n-Octyl-ß-D-glucopyranoside and Digitonin) Triton X100 in a concentration of 1% was chosen for antigen solubilization. Best RNA yield was obtained using a mixer mill and a guanidine thiocyanate containing buffer, followed by RNA isolation with Qiagen RNeasy® kits (Fibrous Tissue Mini Kit and Lipid Tissue Mini Kit). RNA isolation kits provided by Roche were less efficient. NS3-ELISAs were of low analytical sensitivity for ear biopsies, maternal antibodies led to negative results. In addition NS3 epitopes are very heat sensitive. In contrast Erns-ELISAs showed high analytical sensitivity. Samples of PI animals without maternal antibodies gave mean titers above 30. Maternal antibodies had limited effects. In samples of nine PI animals with colostral antibodies the lowest titer was 13. Relevant temperatures by sample drying and storage led to minor titer reductions. The real time RT-PCR resulted in a sensitivity more than 104 fold over the detection limit, even in calves in the time of neutralizing antibodies. Bacterial or fecal contamination before sample drying had no relevant influence on the stability of Erns and 5’UTR RNA. Erns-ELISAs and real time RT-PCR seem to be suitable for detecting BVDV in dried ear notch samples of PI animals. Before appliance in BVDV eradication programs, the diagnostic sensitivity and specificity of tests using ear biopsies have to be evaluated by studies in the field with an adequate number of samples and an appropriate monitoring.

Abstract

Die frühe Detektion von persistent BVDV infizierten (PI) Rindern stellt die Grundlage für die Ausrottung dieses Erregers aus den Nutztierbeständen dar. Trockenkonservierte Ohrstanzen, die im Rahmen der Tiermarkierung gewonnen werden können, stellen als Probenmaterial einen neuen Ansatzpunkt für die Diagnostik neugeborener PI Kälbern dar. Ziele dieser Arbeit waren die Etablierung von Methoden zur Antigen- und RNA-Freisetzung bzw. -Isolierung aus Ohrstanzen, der Vergleich der analytischen Sensitivität verschiedener Testsysteme und die Untersuchung der Stabilität der Analyten gegenüber Umwelteinflüssen. Kommerzielle NS3-, Erns- und Antigen-Mix-ELISAs, ein AK-Blocking-ELISA und zwei real time RT-PCR-Systeme zum Nachweis der 5’UTR wurden zum BVDV-Nachweis verwendet. Als Untersuchungsmaterial dienten Ohrgewebeserien von neun BVDV-Antikörper-freien PI Tieren (BVDV-I CR4043) und zwölf neugeborenen PI Kälbern (BVDV-1 PT810) in der kolostralen Phase. Zur Solubilisierung der BVDV-Antigene stellten sich SDS, Deoxycholat und EMPIGEN als unbrauchbar heraus. Von den geeigneten Tensiden (CHAPS, Triton X100, Nonidet P-40, Tween 20, OGP und Digitonin) wurde Triton X100 in 1%iger Konzentration als Standard-Detergens verwendet. Die höchste Ausbeute bei der RNA-Isolierung wurde bei der mechanischen Probenzerkleinerung in einer Laborschwingmühle, unter Verwendung eines Guanidiniumthio-zyanat-haltigen Puffers und bestimmten Qiagen RNeasy® Kits (Fibrous Tissue Mini Kit und Lipid Tissue Mini Kit) zur RNA-Isolierung erzielt. Produkte der Firma Roche waren weniger geeignet. NS3-ELISAs zeigten bei der Untersuchung von Ohrstanzen eine geringe analytische Sensitivität, maternale Antikörper führten zu negativen Ergebnissen. Zudem zeigten sich die NS3-Epitope instabil gegenüber höheren Temperaturen. Im Gegensatz dazu zeigten Erns-ELISAs eine hohe analytische Sensitivität. Proben von Antikörper-freien PI Tiere erzielten mittlere AG-Titer von über 30. Kolostrale Antikörper hatten einen geringeren Einfluss auf Erns-ELISAs. Der niedrigste AG-Titer bei PI Kälbern in der kolostralen Phase lag bei 13. Hohe Lagerungstemperaturen führten zu einer geringen Titer-Reduktion. Die Ergebnisse der real time RT-PCR lagen mehr als 104fach über der Nachweisgrenze, auch bei PI Kälbern in der kolostralen Phase. Bakterielle und fäkale Kontaminationen hatten keinen relevanten Einfluss auf die Stabilität und Nachweisbarkeit des Erns und der 5’UTR. Der Erns-Nachweis mittels ELISA und die real time RT-PCR scheinen aufgrund ihrer analytischen Sensitivität sehr gut für den Nachweis persistent BVDV infizierter Tiere jeden Alters geeignet zu sein. Die Überprüfung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität der Ohrstanz-Diagnostik im Rahmen eines BVDV-Bekämpfungsprogrammes kann indessen nur durch breit angelegte Feldstudien mit ausreichenden Probenzahlen und geeigneten Kontrollmaßnamen erreicht werden.