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Bisle, Birgit (2007): Das Membranproteom halophiler Archaea - Identifizierung und Quantifizierung. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Membranproteine als Mediatoren zwischen extrazellulären Reizen und intrazellulären Prozessen sind trotz ihrer enormen biologischen Bedeutung in Proteomstudien meist unterrepräsentiert. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die kartierende und quantitative Analyse des Membranproteoms am Beispiel der Modellorganismen Halobacterium salinarum und Natronomonas pharaonis. Grundlage war die Entwicklung einer optimierten Membranisolierung für halophile Archaea unter Beibehaltung hoher Salzkonzentrationen. Nach Zellaufschluss durch Beschallen wurden die so generierten Membranvesikel über Zuckergradienten-Dichtezentrifugation aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Salzkonzentrationen nicht nur zur Stabilisierung der Membran sondern auch der Membranproteinkomplexe notwendig sind. Für die Analyse von halophilen Membranproteinkomplexen wurde die Blue Native Elektrophorese-Technik etabliert und adaptiert, sodass salzhaltige Proben untersucht werden konnten. Anhand dieses Systems konnten z.T. unbekannte Proteininteraktionen nachgewiesen werden. Da integrale Membranproteine mit der klassischen 2D-Elektrophorese nicht getrennt werden können, wurde für die zweidimensionale gelbasierte Darstellung des Membranproteoms das 16-BAC/SDS-System etabliert und bezüglich Trennleistung optimiert. Die Identifizierung von Proteinsspots war für membranassoziierte Proteine mit der peptide mass fingerprinting Methode erfolgreich, diese Technologie ist jedoch für die Analyse von integralen Membranproteinen stark eingeschränkt. Deren Inventarisierung erfolgte über einen LC-MS/MS Ansatz. Die auch bei dieser Technik beobachteten Schwierigkeiten konnten darauf zurückgeführt werden, dass Peptide, die membranintegrale Bereiche repräsentieren, spezifisch an langkettigen reversed phase Materialien verloren gehen und sich daher einer Analyse entziehen. Aus diesem Grunde war die Abreicherung membranassoziierter Proteine während der Membranisolierung durch ein mildes Detergens entscheidend, sodass integrale Proteine angereichert und der Analyse zugeführt werden konnten. Durch einen 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Ansatz wurden so 50% des vorhergesagten integralen Membranproteoms von H. salinarum und 32% des integralen Membranproteoms von N. pharaonis identifiziert. Damit war die Grundlage geschaffen, die Veränderungen im Membranproteom von H. salinarum, hervorgerufen durch unterschiedliches Energie- und Nahrungsangebot, zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die quantitative Membranproteomik erstmals die differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) mit dem 16-BAC/SDS-System kombiniert. Diese gelbasierte Quantifizierungsstrategie ermöglicht nicht nur eine Übersicht über das Ausmaß der Regulation des gesamten Proteoms, sondern auch die Quantifizierung einzelner Proteinspots unabhängig von deren Identifizierung. Mit einer grundlegend anderen, massenspektrometrie-basierten Technologie wurden diese Ergebnisse verifiziert und erweitert. Theoretische Berechnungen zeigten, dass auch bei diesen Analysen die Quantifizierung integraler Membranproteine erschwert ist, da wesentlich weniger Peptide pro Protein als bei löslichen Proteinen für eine Quantifizierung zur Verfügung stehen. Sie zeigten aber auch, dass die Markierung freier Aminogruppen mit isotopenmarkierten Sonden, wie die Nicotinoylierung (ICPL), für Membranproteine erfolgreicher ist, als eine Cystein-basierte Markierungsstrategie. Mit Hilfe der ICPL-Technologie, die in dieser Arbeit erstmals für Membranproteine angewandt wurde, war es möglich am Beispiel von aerob und phototoph kultivierten Zellen für 155 Membranproteine quantitative Information zu erhalten, darunter 101 integrale Membranproteine. Das am stärksten regulierte Protein war, wie zu erwarten, das photosynthetisch aktive Protein Bacteriorhodopsin. Daneben konnten weitere am aeroben und anaeoben Energiemetabolismus beteiligte Proteine als reguliert identifiziert werden. Die insgesamt überraschend geringen Regulationen auf Ebene des Membranproteoms, welche sich sowohl aus der gelbasierten als auch bei der massenspektrometrie-basierten Analyse ergaben, könnten eine günstige Überlebensstrategie für Organismen in ökologische Nischen mit geringem selektivem Druck darstellen.