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Schnee, Margit (2007): Protein fragment complementation assay for studying viral protein-protein interactions. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Herpesviruses cause highly prevalent infections associated with usually mild symptoms resulting in life long latency. However, they can provoke fatal disease in susceptible individuals such as immunocompromised patients either in the context of primary infection or after reactivation from latency. Despite of their emerging medical importance, herpesvirus infections can so far only be controlled by antiviral therapy targeting viral DNA replication, accompanied with side effects and occurrence of resistant strains. In this work, a novel platform for drug discovery was established that is based on a protein complementation assay (PCA), which can be used to study viral protein-protein interactions in a simple cell based assay. In a PCA two inactive fragments of a reporter enzyme are fused to two interacting proteins. Interaction of the proteins leads to proximity of the enzyme fragments, followed by reconstitution of the reporter enzyme activity. Members of the UL34 and UL31 families are conserved herpesvirus proteins. They interact with one another forming the nuclear egress complex (NEC), which is essential for the export of viral capsids from the cell nucleus. This crucial protein-protein interaction might serve as a potential drug target for anti-herpesvirus chemotherapy. In this work the mutual binding sites of the two proteins were localized and studied for their conservation. A PCA was established for M50 and M53 – the NEC proteins of the murine cytomegalovirus (MCMV) - by fusion of the N- and C-terminal part of the TEM-1 ß-lactamase of E. coli. The assay was validated and applied to representative members of the three herpesvirus subfamilies. Cross-complementation assays showed that partners derived from the same subfamily can replace each other in the PCA, however, homologues from different subfamilies can not. This cross-complementation reflects the in vivo situation: the human cytomegalovirus (HCMV), but not the HSV-1 or PrV homologues are able to rescue the M50 or M53 null phenotype in the viral context of MCMV. The lack of complementation between the subfamilies is due to their diverged binding sites, which are located in all cases within the first conserved region of the UL31 family proteins. The study of the binding site in UL34 family members revealed a bipartite binding motif. With the aim of a future high-throughput inhibitor screen an in vitro NEC-PCA was established using purified fusion proteins of HCMV.

Abstract

Herpesviren verursachen weit verbreitete und in immunkompetenten Menschen meist mit milden Symptomen einhergehende Infektionen, welche zu lebenslanger Latenz der Viren im Körper führen. In immunsupprimierten Patienten verursachen die Viren während einer Erstinfektion oder der Reaktivierung aus der Latenz jedoch drastische Symptome. Trotz wachsender Bedeutung von Herpesvirusinfektionen ist derzeit eine Behandlung nur durch Medikamente, welche die virale DNS Polymerase angreifen, möglich. Diese rufen schwerwiegende Nebenwirkungen hervor und führen zudem zum Entstehen resistenter Virusstämme. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Plattform für das Prüfen von Inhibitoren etabliert. Sie basiert auf einem Protein Complementations Assay (PCA), welcher eine einfache Untersuchung von Proteininteraktionen auf zellulärer Ebene erlaubt. In einem PCA werden zwei inaktive Proteinteile eines Reporterenzyms mit Proteinen verschmolzen, deren Interaktion zur räumlichen Nähe der beiden Enzymteile und zur aktiven Form des Reporterenzyms führt. Proteine der konservierten UL34 und UL31 Proteinfamilien interagieren miteinander und bilden den sogenannten Kern-Austritt-Komplex. Dieser ist wichtig für das Ausschleusen von Viruskapsiden aus dem Kern, und stellt somit einen möglichen Angriffspunkt neuer Therapeutika gegen Herpesviren dar. Der PCA wurde durch die Fusion des N- und C-terminalen Teil der TEM-1 ß-lactamase an die beiden NEC Proteine des murinen Cytomegalovirus (MCMV), M50 und M53, etabliert und später auf UL34 und UL31 Proteine repräsentativer Viren der drei Herpesvirusunterfamilien ausgeweitet. Experimente zur Kreuzreaktion zeigten, dass Proteine von Herpesviren der gleichen Unterfamilie im PCA interagieren können, homologe Proteine anderer Unterfamilien jedoch nicht. Die Fähigkeit der Kreuzreaktion im PCA spiegelt die Situation im Virus wieder: die homologen Proteine des humanen Cytomegalovirus (HCMV), jedoch nicht Proteine von HSV-1 oder PrV, ermöglichen das Wachstum eines M50 oder M53 defizienten MCMV. Das Scheitern einer Kreuzreaktion zwischen den Unterfamilien ist auf divergente Entwicklung der Bindedomänen zurückzuführen. In dieser Arbeit konnte die Bindedomäne in UL31 Proteinen in der ersten konservierten Region lokalisiert werden, in UL34 Proteinen wird ein zweigeteiltes Bindemotiv vermutet. Im Hinblick auf ein späteres Hochdurchsatzverfahren zur Entdeckung neuer Inhibitoren des HCMV, wurde ein in vitro NEC-PCA entwickelt.