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Alesik, Eva (2006): Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe bei Arcanobacterium pyogenes: Etablierung und Anwendung der Empfindlichkeitsbestimmung mittels Bouillonmikrodilution sowie genotypische Charakterisierung tetracyclinresistenter Stämme. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Stämme der Spezies Arcanobacterium (A.) pyogenes gelten allgemein als empfindlich gegenüber Penicillinen. Hauptsächlich aus diesem Grund gibt es bisher keine etablierte Methode zur Empfindlichkeitsbestimmung von A. pyogenes. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für A. pyogenes eine Methode zur Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) mittels Bouillonmikrodilution erarbeitet, die sich an der Vorgehensweise des CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA)-Dokumentes M31-A2 orientiert. Mit Hilfe der erarbeiteten Methode wurden die MHK-Werte zweier Bakterienkollektive mit insgesamt 115 Bakterienstämmen [53 süddeutsche Isolate sowie 62 deutschlandweit im Rahmen eines Monitoringprogramms (Bft-GermVet) gesammelte Stämme] bestimmt. Zusätzlich wurde die genetische Grundlage der dabei häufig zu beobachtenden Tetracyclinresistenz untersucht. Bei Anwendung der vom CLSI-Dokument empfohlenen Verdünnung der Bakteriensuspension im Medium im Verhältnis 1:200 wurde die Inokulumsdichte von A. pyogenes im Vergleich zum vorgeschriebenen Dichtebereich etwa um das Dreifache über-schritten. Daher wurde eine Verdünnung im Verhältnis 1:667 vorgenommen, wodurch valide Inokulumsdichten erreicht wurden. In der vom CLSI-Dokument empfohlenen kationenadjustierten Müller-Hinton-Bouillon (CaMHB) konnte ohne weitere Zusätze kein ausreichendes Bakterienwachstum erreicht werden, unter Zusatz von 2 % fetalem Käl-berserum (FKS; aufgrund des Vorhandenseins von Thymidin nur für die Testung nicht-sulfonamidhaltiger Antibiotika verwendbar) oder 2 % lysiertem Pferdeblut konnte die MHK nach 24 Stunden gut abgelesen werden. Aerob (von der CLSI-Norm empfohlen) und unter Zusatz von 3 Vol% CO2 bebrütete Mikrotiterplatten wiesen nach 24 Stunden keine relevanten Unterschiede in der MHK der untersuchten Wirkstoffe auf. Aufgrund der besseren Ablesbarkeit wurde der Inkubation unter Zusatz von CO2 der Vorzug gegeben. Die aus dem süddeutschen Raum stammenden A. pyogenes-Stämme wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Tetracyclin, Penicillin G und Erythromycin untersucht. Im Rahmen des BfT-GermVet-Projekts wurden die Isolate auf ihre Empfindlichkeit gegenüber 24 verschiedenen Wirkstoffen geprüft. Eine qualitative Bewertung als „resistent“ oder „sensibel“ konnte anhand der im Dokument M31-A2 vorhandenen Grenzwerte nur für wenige Wirkstoffe (Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalothin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Sulfa-methoxazol/Trimethoprim, Sulfamethoxazol; Ampicillin und Penicillin unter Vorbehalt) vorgenommen werden. Gegenüber den getesteten β-Lactam-Antibiotika, Aminoglykosiden, Fluorchinolonen und Phenicolen wurden generell niedrige MHK-Werte beobachtet, die - soweit Grenzwerte vorhanden waren - im sensiblen Bereich lagen. Bei der Testung von Sulfonamiden und potenzierten Sulfonamiden kam es zu großen Unterschieden zu früheren Studien, was jedoch eher auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist als auf Änderungen der Resistenzraten. Gegenüber Sulfamethoxazol/Trimethoprim waren alle Stämme empfindlich, gegenüber Sulfamethoxazol waren die porcinen Isolate ebenfalls empfindlich, die bovinen Stämme wiesen je nach Indikation eine Resistenzrate von 24 bis 32 % auf. Insgesamt waren 9,5 % der untersuchten Isolate resistenzverdächtig gegenüber Makrolid-Antibiotika. Diese im Vergleich zur Literatur niedrige Zahl ist entweder durch die unterschiedlichen Isolatzahlen bedingt oder tatsächlicher Ausdruck eines Resistenzrückgangs, der mit dem Verbot von Tylosin als Futtermittelzusatzstoff in den 1990er Jahren assoziiert sein könnte. Bei der Untersuchung von Tetracyclin erwiesen sich unabhängig von der Tierart über 60 % der Isolate als resistenzverdächtig, wobei die MHK90 beim Schwein bei 8 µg/ml und beim Rind bei 64 µg/ml lag. Bei der genetischen Untersuchung von 36 tetracyclinresistenten Isolaten aus Süddeutschland auf das Vorkommen von acht verschiedenen tetracyclinresistenzvermittelnden Genen konnte bei 66,7 % der Isolate das für ein ribosomales Schutzprotein kodierende Resistenzgen tet(W) detektiert werden, das in der Literatur als hauptverantwortlich für die Tetracyclinresistenz bei A. pyogenes gilt. Neben diesem konnte auch die strukturelle Einheit eines für ein Effluxprotein kodierenden Gens, tet(33), bei 22,2 % der Isolate nachgewiesen werden. Bei keinem Stamm konnte tet(33) ohne gleichzeitig vorhandenes tet(W) isoliert werden. Die in der Literatur beschriebene Lokalisation von tet(33) auf einem Plasmid konnte für die untersuchten Stämme nicht bestätigt werden. Bei allen tet(W)- und tet(33)-positiven Isolaten handelte es sich um Stämme boviner Herkunft. Der MHK-Wert der tet(W)-positiven Isolate lag zwischen 8 und 64 µg/ml, die Mehrheit der Stämme hatte eine MHK von 16 µg/ml. In Anwesenheit von tet(33) lag die MHK bei sieben von acht Isolaten bei 32 µg/ml, ein Isolat wies eine MHK von 64 µg/ml auf. Bei einem Isolat boviner Herkunft (4371-03), bei dem weder tet(W) noch tet(33) detektiert werden konnte, konnte erstmals für Arcanobakterien die regulatorische Einheit des Gens tet(Z), das bisher nur bei Corynebacterium glutamicum beschrieben wurde, identifiziert werden. Das Strukturgen tetA(Z), das ebenfalls für ein Effluxprotein kodiert, konnte nur partiell nachgewiesen werden. Es ist daher nicht bekannt, ob die bei 4371-03 beobachtete MHK von 8 µg/ml auf das identifizierte tet(Z) zurückzuführen ist. Insgesamt blieben elf Isolate einschließlich aller Stämme porciner Herkunft (N = 8) ohne zugeordnete tet-Determinante.