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Rößle, Birgit (2001): Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Borrelien: Ultrastruktur und Immuncytologie. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Lyme Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit des Menschen auf der Nordhemisphäre. Der Erreger Borrelia burgdorferi s. l. wird in drei humanpathogene Arten, B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii unterteilt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Struktur von Borrelia afzelii am Beispiel des Stamms PKo, dem Hautisolat eines Patienten, mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden untersucht. Raster- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen an Borrelien des B. afzelii Stammes PKo wurden zur Aufklärung der Ultrastruktur der Borrelienzelle unter in vitro Kultur- Bedingungen durchgeführt. In Abhängigkeit vom Kulturalter zeigen die Borrelien starke strukturelle Veränderungen, die rasterelektronenmikroskopisch gut zu untersuchen sind. Während der log-Phase nimmt die Anzahl der Schraubenwindungen zu und somit auch die Länge der Borrelien. Gegen Ende der log- Phase verlieren die Borrelien ihre typische Schraubengestalt. Im Lichtmikroskop (Dunkelfeld) kann man gleichzeitig einen Verlust der Beweglichkeit beobachten. Allerdings bedeutet der Verlust der Beweglichkeit nicht wie bisher angenommen gleichzeitig den Tod der Borrelien, da sich nach dem Überimpfen in frisches Kulturmedium wieder bewegliche schraubenförmige Borrelien bilden. Die Untersuchungen zur Ultrastruktur der Borrelienzelle wurden an Borrelien aus der log-Phase der Kultur durchgeführt. Die Borrelienzellen sind zu diesem Zeitpunkt 10–20 µm lang und besitzen 3–9 Schraubenwindungen. Ultradünnschnitte zeigen, daß die Borrelien aus einem Protoplasmazylinder bestehen, der von einer 4 nm dünnen Zellmembran begrenzt wird. An ihn schließt sich im Abstand von 5 nm die Zellwand an. Die Borrelienzellen sind von einer äußeren Membran umgeben, die den periplasmatischen Raum umschließt. Diese Membran ist zu einem Tunnel aufgewölbt in dem die Endoflagellen liegen. An jedem Zellende befinden sich 7–9 Flagellenansatzstellen, die in der Längsachse der Borrelienzelle angeordnet sind. Jede der Flagellen inseriert nur an einem Zellende. Im mittleren Bereich der Borrelienzelle kommt es zu einer Überlappung der Flagellen der beiden Zellenden. Die Überlappungsregion ist jedoch nur undeutlich abzugrenzen. Auf Grund dieser Untersuchungen konnte ein detailliertes, maßstabsgetreues Modell einer Borrelienzelle rekonstruiert werden. Ein weiteres Untersuchungsziel war die Aufklärung der Lokalisation wichtiger immundominanter Proteine. Mit Hilfe von Immun-Gold-Markierungen konnte durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie gezeigt werden, daß die Proteine p17 (Osp17), p35 (Osp35) und p58 (Osp58) auf der Oberfläche der äußeren Membran der Borrelienzelle lokalisiert sind. Durch die Optimierung der Markierungsmethode konnte das Signal so weit gesteigert werden, daß die gleichmäßige Verteilung dieser Proteine über die gesamte Zelloberfläche dargestellt werden konnte. Auf Grund ihrer Lokalisation auf der Oberfläche der Borrelienzelle kommen diese Proteine grundsätzlich als Vakzinekandidaten in Frage. Die Lokalisation typspezifischer und konservierter Epitope der beiden immunologisch heterogenen Oberflächenproteine OspA und OspC konnte durch Immun-Gold-Markierungen mit Hilfe typspezifischer und breitreaktiver monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden. Typspezifische und konservierte Epitope beider Proteine befinden sich auf der Oberfläche der äußeren Membran. Die Lokalisation breitreaktiver Epitope von OspA und OspC auf der Oberfläche der Borrelienzelle läßt den Einsatz dieser Proteine als Impfantigene auch im europäischen Raum erfolgversprechend erscheinen. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt kokkoide Morphotypen der Borrelienzelle zu erzeugen. Durch die Inkubation von Borrelien in Aqua dest. gelingt es innerhalb weniger Minuten auf reproduzierbare Weise diese Formvarianten der Borrelien zu erzeugen. Mittels Vitalfärbungen konnte gezeigt werden, daß es sich bei den kokkoiden Morphotypen um lebende Formvarianten der Borrelienzelle handelt. Diese Formvarianten sind nicht kultivierbar. Nach dem Überführen in Kulturmedium sind nach 4–5 Tagen nur noch schraubenförmige Borrelienzellen zu beobachten. Bei den kokkoiden Morphotypen handelt sich um eine kugelförmige Anschwellung der äußeren Membran in der sich der Protoplasmazylinder in engen Windungen aufrollt. Der vom aufgerollten Protoplasmazylinder umgebene Raum ist weitgehend strukturlos. Die Flagellen befinden sich auf der von der äußeren Membran abgewandten Seite es Protoplasmazylinders. Die Rekonstruktion von Serienultradünnschnitten ergab, daß diese kokkoiden Morphotypen jeweils von einer einzelnen Borrelienzelle gebildet werden; Protoplasmazylinder, Zellwand und äußere Membran bleiben intakt. Darüber hinaus konnte am Beispiel von Osp17, Osp35 und OspC gezeigt werden, daß die Oberflächenproteine der schraubenförmigen Borrelienzelle auch bei den kokkoiden Morphotypen auf der Oberfläche lokalisiert sind. Diese drei Proteine sind auch auf den kokkoiden Morphotypen gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt. Allerdings kommt es bei der Bildung der kokkoiden Morphotypen im Vergleich zu den schraubenförmigen Borrelienzellen zu einer deutlichen Reduktion der Oberfläche. Diese Formvarianten besitzen somit nur eine reduzierte Angriffsfläche für die Antikörper des Wirts. Sie stellen also möglicherweise Formen dar, die es den Borrelien ermöglichen dem Abwehrsystem des Wirts auszuweichen. Außerdem wurde die Adhäsion von Borrelien zweier unterschiedlicher Spezies an humane Astrozyten untersucht. Dafür wurde außer dem bereits erwähnten B. afzelii Stamm PKo der B. garinii Stamm PBi eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Isolat aus dem Liquor eines Patienten. In einem über 24 Std. Zeitdauer durchgeführten Koinkubationsversuch konnte mittels Lichtmikroskopie gezeigt werden, daß beide Stämme an die Astrozyten adhärieren. Borrelien des B. afzelii Stamms PKo adhärieren jedoch insgesamt weit häufiger als solche des B. garinii Stamms PBi. Bei den rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigte sich, daß eine Vielzahl von Borrelien beider Stämme mit den Zellausläufern am Rand der Astrozyten und auf deren Oberfläche in Kontakt treten. Die Fähigkeit der Borrelien an die Astrozyten zu adhärieren spielt möglicherweise eine Rolle beim Übertritt von der Blutbahn ins Gehirn. Eine deutlich Reaktion der Astrozyten auf den Kontakt mit den Borrelien in Form von Oberflächenveränderungen ist nicht zu erkennen. Bei beiden Stämmen können im Rahmen der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen Borrelien gefunden werden, die in die Zellen eindringen. Dieses Eindringen kann mit Hilfe von Ultradünnschnitten durch die Koinkubationspräparate im TEM bestätigt werden. Hierbei konnten Borrelien sowohl in Vesikeln, als auch frei im Zytoplasma derAstrozyten gefunden werden. Die intrazellulär liegenden Borrelien waren auch nach 24 Std. noch intakt. Es sind keine Degenerationsformen zu erkennen. Durch das Eindringen in die Astrozyten gelingt es den Borrelien möglicherweise über längere Zeit im Wirt zu überdauern.