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Bolzer, Andreas (2002): Analyse der Chromosomenverteilung in menschlichen Fibroblasten mittels 3D-Vielfarben Fluoreszenz in situ Hybridisierung. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

In human diploid fibroblasts (HDFs) the cell nucleus is oval in shape, quite large in xy-diameter (10-20µm), but flat in z-direction (5µm). In these nuclei chromosome territories typically lie side by side or slightly above each other. The question whether these arrangements are ordered or variable has yielded conflicting answers. We hybridised an improved 7-fluorochrome MFISH probe set on 3D-preserved cell nuclei, fixed with buffered 4% paraformaldehyde. A LEICA wide field microscope with an 8-filter-wheel and an automated z-step motor was used for imaging of the 7 fluorochromes plus DAPI. Multicolor images from nuclei were taken as serial sections in z-direction. After deconvolution, a specifically developed Program goldFISH Saracoglu K. et al. 2001 was used to classify the images according to the labelling scheme. The classification algorithm corresponds to the procedure previously used for metaphase spreads, now adopted to 3-D studies of chromosome territory arrangements in the cell nucleus. The analysis of 30 G0-fibroblast nuclei and 30 prometaphase rosettes revealed a pronounced variability of chromosome territory neighbourhoods, as described by Allison D. C. et al. 1999, but in contrast to Nagele R. et al. 1995. However we noted a distinct radial order: small chromosomes were located close to the centre while large chromosomes were positioned towards the nuclear rim. This non-random radial positioning could also be observed in prometaphase rosettes

Abstract

Die Erforschung von Chromosomenpositionen im menschlichen Zellkern führte zu kontroversen Ergebnissen: In Lymphozyten konnte eine radiale Chromosomenposition entdeckt werden, die von der Gendichte der Chromosomen abhing (Boyle A. L. et al. 1990; Cremer M. et al. 2001). Genreiche Chromosomen lagen zentraler im Zellkern als genarme. In Fibroblasten wurde zwar ebenfalls eine radiale Verteilung gefunden, jedoch korreliert diese besser mit der genomischen Größe der Chromosomen. Hier lagen kleinere Chromosomen zentraler als größere (Sun et al. 2000). Darüberhinaus finden einige Publikationen eine starr gegenüberliegende und fixierte nachbarschaftliche Anordnung (Nagele et al. 1995), andere hingegen eine zufällige Nachbarschaft (Allison und Nestor 1999). Weitfeldmikroskoptechnik, Dekonvolution und Klassifikation: Ein Großteil der Arbeit betraf die Etablierung und das Testen eines 3D-Mikroskopie- und Dekonvolutions-System für M-FISH Präparate. Ein Leica Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop wurde mit einem Filterrad für acht Bandpassfilter und einem z-Schrittmotor für den Mikroskoptisch ausgestattet. Die Software zu Steuerung wurde in Zusammenarbeit mit Leica Microsystems angepasst. Nach Aufnahme der Bildstapel wurden sie der Dekonvolution unterzogen, um sie auf die Qualität konfokaler Bilder anzuheben. Für die Dekonvolution war es nötig die richtigen Programme und Parameter herauszufinden. ReFISH-Präparate konnten mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen werden, jedoch war es nötig das Präparat nach der ersten Hybridisierung erneut zu waschen und zu denaturieren, um den zweiten, komplementären Sondensatz zu hybridisieren. Die zwei nacheinander aufgenommenen Bildstapel mussten mit einem Alignmentprogramm aneinander angeglichen werden. Schließlich wurde es durch die Erweiterung des Karyotypisierungsprogramms auf 3 Dimensionen möglich, Chromosomenterritorien im Zellkern automatisch zu bestimmen. Das Programm klassifiziert die Regionen anhand des Markierungsschemas und weist jedem erkannten Chromosomenterritorium eine Klassifikationsfarbe zu. Die Schwerpunkte der Chromosomenterritorien wurden in eine Ausgabetabelle geschrieben. Die daraus berechneten Abstände und Winkel liessen eine Aussage bezüglich der Chromosomentopologie zu. Chromosomenpositionen in Fibroblasten: In allen Experimenten an G0-Fibroblasten und Prometaphaserosetten wur-de in den Kernen eine größenabhängige, radiale Verteilung der Chromoso-menterritorien gefunden, wobei kleinere Chromosomen allgemein zentraler lagen als größere. Eine starre Ordnung, wie sie in Nagele et al. (1995) pro-pagiert wurde, konnte nicht nachvollzogen werden. Vielmehr stellte sich heraus, dass die nachbarschaftliche Anordnung der Chromosomen im Zell-kern weitgehend zufällig ist