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Werner, Denise (2002): The Effect of Iron Overload on the Long-term Toxicological Effects of Fumonisin B1 in Rat Liver. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The long-term toxicological effects of hepatic iron overload on the cancer initiating and promoting properties of fumonisin B1 (FB1) were investigated in male Fisher 344 rats. An initial pilot (dose response) study over 15 weeks was performed to determine a level of dietary iron that achieves a high hepatic iron concentration in the absence of significant side effects, to be used in the subsequent long-term carcinogenesis study with FB1. Doses of 1%, 1.5% and 2% dietary carbonyl iron (Fe) were used for 10 weeks, followed by a level of 0.5% Fe for another 5 weeks. After 10 weeks of feeding 1% Fe, the hepatic iron level was 30-fold that of controls. Following the reduction in dietary iron to 0.5%, the hepatic iron level was maintained and side effects were minimal. Irrespective the dose of iron, the iron deposition was initially confined to zone 1 (periportal region), but with increased iron loading, extended to zone 2 (mid-zonal region) and zone 3 (perivenular region). Iron overload was shown to increase hepatocellular proliferation as seen in labelling of cells with 5-bromo-2’-deoxy-uridine (BrdU). Lipid peroxidation, measured as MDA, was also significantly enhanced by excess iron and levels correlated the iron dosage. In the long-term study, half of the rats were submitted to an iron-loading regimen with 1% Fe for 10 weeks, while the other half received the powdered AIN-93M diet only. The iron was then reduced to 0.5%; the rats were divided into four treatment groups: FB1/Fe (n=15); Fe (n=14); FB1/AIN (n=15); and control group (n=15), respectively. FB1 was fed at 250 mg/kg AIN-93M diet for 5 weeks, followed by 100 mg/kg for 20 weeks. The effect of iron on FB1-induced initiation and promotion was assessed in 5 rats from each group at week 35. FB1 was removed from the diet of the remaining rats but iron supplementation continued for 25 weeks. The rats were terminated and the effect of dietary iron on the progression phase of FB1-induced carcinogenesis was assessed. The feed intake of rats from the Fe group (weeks 4-10), and FB1/Fe and FB1/AIN groups (weeks 10-60) was measured daily and the other groups were given averaged feeding accordingly; thus, the total body weight gain (tBWG) gain did not differ significantly between groups. Excess iron significantly increased the liver to body weight (LW/BW) ratio; however, iron could not counteract the mitoinhibitory effect of FB1 on hepatocyte proliferation and the LW/BW ratio of the FB1/Fe group was significantly lower than the Fe group. During the 25-week FB1-treatment period, more foci and nodules of dysplastic cells developed in the FB1/Fe group than in the FB1/AIN group. After removal of FB1, the number of nodules remained constant in the FB1/Fe group, while increasing in the FB1/AIN group. Initially, the pattern of iron deposition was the same as in the pilot study. Hepatocyte necrosis caused by FB1 then resulted in a shift of iron from hepatocytes to Kupffer cells and portal tract macrophages. FB1/Fe resulted in increased hepatocellular proliferation as demonstrated by increased BrdU labelling at 35 weeks. The withdrawal of FB1 reversed this effect and the index of BrdU labelling decreased to even lower levels than the Fe and FB1/AIN groups. Hepatic iron was almost 9-fold that of controls at 10 weeks; a significant increase in the hepatic iron levels in the FB1/Fe group was noticed as compared to all other groups. However, after removing FB1, the hepatic iron decreased to the same level as seen in the Fe group. During the FB1 treatment period, MDA increased in the FB1/Fe group to levels significantly higher than in the FB1/AIN and control groups. The present study suggests a dual role of iron overload in cancer development during FB1-induced carcinogenesis. During the cancer initiation/promotion phase, iron overload in combination with FB1 enhanced the susceptibility of the liver to the formation of foci and nodules; but after removal of FB1, continued supplementation of iron impaired the progression of pre-neoplastic hepatic lesions.

Abstract

In der vorliegenden Studie wurden die Langzeitwirkungen einer hepatischen Eisenbelastung auf das krebserzeugende bzw. –fördernde Potential von Fumonisin B1 (FB1) an männlichen Fisher 344 Ratten untersucht. Vorab wurde in einem 15-wöchigen Vorversuch der für eine Langzeitkarzinogenese-Studie geeignete Eisenanteil im Futter ermittelt, welcher eine möglichst hohe Eisenkonzentration in der Leber, jedoch noch keine signifikanten Nebenwirkungen hervorruft. In den ersten 10 Wochen wurden Konzentrationen von 1%, 1,5% und 2% Karbonyleisen (Fe) im Futter verwendet, um die letzten 5 Wochen mit einem 0,5%-igen Eisengehalt fortzufahren. Nach einer 10-wöchigen Fütterung von 1% Fe wurde gegenüber den Kontrolltieren eine um das 30-fache höhere Eisenkonzentration in der Leber erreicht. Bei der folgenden Reduktion des Futtereisengehaltes auf 0,5% wurde diese Eisenkonzentration in der Leber aufrechterhalten, die Nebenwirkungen waren minimal. Unabhängig von der Höhe der Eisendosierung erfolgte die Eisenablagerung anfänglich in Zone 1 (Läppchenperipherie), erstreckte sich jedoch mit zunehmender Eisensättigung auch auf die Zonen 2 (mittlere Läppchenzone) und 3 (Läppchenzentrum). Mittels Zellmarkierung mit 5-Brom-2’-Desoxy-Uridin (BrdU) wurde eine durch Eisenbelastung induzierte hepatozelluläre Proliferation nachgewiesen. Weiterhin wurde durch den Eisenüberschuss eine dosisabhängige Steigerung der Lipidperoxidation (gemessen als Malondialdehyd (MDA)) festgestellt. Im Hauptversuch wurde die Hälfte der Tiere 10 Wochen lang entsprechend eines 1%-igen Eisenanreicherungsschema gefüttert, wohingegen der anderen Hälfte ausschliesslich AIN-93M-Futter verabreicht wurde. Anschließend wurde der Eisenanteil auf 0,5 % reduziert. Die Tiere wurden in 4 Gruppen unterteilt: FB1/Fe (n=15), Fe (n=14), FB1/AIN (n=15) und Kontrollgruppe (n=15). FB1 wurde 5 Wochen lang in einer Dosierung von 250 mg/kg AIN-93M-Futter verwendet, gefolgt von 100 mg/kg für weitere 20 Wochen. Die Auswirkung von Eisen auf die FB1–induzierte Tumorentstehung bzw. -progression wurde an je 5 Ratten pro Versuchsgruppe in der 35. Woche untersucht. Die übrigen Tiere erhielten nun FB1–freies Futter, während hingegen Eisen über weitere 25 Wochen supplementiert wurde. Anschließend wurden die Ratten getötet und die Beeinflussung der Progressionsphase der FB1–induzierten Karzinogenese durch Fütterungseisen untersucht. Um eine auf täglicher Basis gleiche Futtermengenaufnahme aller Ratten zu gewährleisten, wurde von Woche 4-10 entsprechend des Durchschnitts der Fe-Gruppe gefüttert, von Woche 10-60 diente die Menge der FB1/Fe- und FB1/AIN-Gruppe als Bezugswert. Es zeigten sich zwischen den einzelnen Gruppen keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Körpergewichtszunahme (tBWG). Bei Eisenüberschuß war eine signifikante Erhöhung des relativen Lebergewichtes (LW/BW) festzustellen; der mitoinhibitorischen Wirkung von FB1 konnte jedoch durch die Eisengabe nicht entgegengewirkt werden, das relative Lebergewicht in der FB1/Fe-Gruppe war gegenüber der Fe-Gruppe signifikant erniedrigt. Innerhalb der 25-wöchigen Gabe von FB1 entwickelten sich in der Leber von Tieren der FB1/Fe-Gruppe entscheidend mehr Foci und Knötchen von dysplastischen Zellen als in der FB1/AIN-Gruppe. Während die Anzahl dieser Foci und Knötchen nach Abschluß der FB1-Gabe in der Gruppe FB1/Fe unverändert blieb, nahm sie in der FB1/AIN-Gruppe weiterhin zu. Das Muster der Eisenablagerung entsprach anfänglich dem des Vorversuches; die durch FB1 hervorgerufenen hepatozytären Nekrosen gingen jedoch mit einer Verlagerung der Eisenspeicherung von Hepatozyten auf Kupffer-Zellen und in den Portalkanälen lokalisierte Makrophagen einher. Wie durch die immunhistochemische Untersuchung mit BrdU in der 35. Woche gezeigt werden konnte, resultierte die Verabreichung von FB1/Fe in einer erhöhten hepatozellulären Proliferation. Das Absetzen der FB1-Gabe verursachte einen gegenteiligen Effekt; der Index der BrdU-Markierung sank sogar auf niedrigere Werte als in den Fe- und FB1/AIN-Gruppen. Die Eisenkonzentration in der Leber betrug nahezu den 9-fachen Wert der Kontrollgruppe in der 10. Woche; ein signifikanter Anstieg der Eisenkonzentration in der FB1/Fe-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen war in Woche 35 zu erkennen. Allerdings sanken die Konzentrationen nach Abschluß der FB1-Gabe auf ähnliche Werte wie in der Fe-Gruppe. Während des Zeitraums der FB1-Fütterung war eine Steigerung der MDA in der FB1/Fe-Gruppe auf signifikant höhere Werte als in den FB1/AIN- und Kontrollgruppen festzustellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen erkennen, daß eine Überversorgung mit Eisen nach FB1-induzierter Karzinogenese die weitere Tumorentwicklung in zweierlei Hinsicht beeinflußt. Während der Tumorinitiation-bzw. Progressionphase ist bei Vorliegen eines Eisenüberschusses in Kombination mit FB1 die Anfälligkeit der Leber für die Ausbildung dysplastischer Foci erhöht; nach Abschluß der Gabe von FB1 verzögert eine weitere Eisensupplementation die Progression der prä-neoplastischen Läsionen in der Leber.