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Gärtner, Andreas (2006): Entwicklung und Charakterisierung von Enzymimmuntests für den Nachweis von Fluorchinolonen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von in der EU-weit geltenden Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 reglementierten Chinolonen. Zur Gewinnung gruppenspezifischer Antikörper wurde Ciprofloxacin-Ethylendiamin an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) gekoppelt und drei Kaninchen intracutan immunisiert. Nach einer Restimulierung waren bei allen drei Kaninchen spezifische Antikörper nachweisbar. Die zur Erstellung eines direkten und indirekten kompetitiven enzymimmunologischen Nachweisverfahrens notwendigen markierten Antigene wurden durch Kopplung von Ciprofloxacin, Ciprofloxacin-Ethylendiamin, Clinafloxacin sowie Norfloxacin an Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase oder Ovalbumin hergestellt. Dabei kamen verschiedene Kopplungsmethoden (aktive Estermethode, Perjodatmethode und Carbodiimidmethode) zum Einsatz. Mit dem spezifischen Serum eines Tieres wurden verschiedene kompetitive Enzymimmun-testsysteme entwickelt. Von den direkten Enzymimmuntests wies das empfindlichste System eine Nachweisgrenze für Ciprofloxacin von 1,25 ng/ml auf, im indirekten Testsystem lag die untere Nachweisgrenze bei 1,5 ng/ml. Ciprofloxacin konnte somit weit unterhalb des geltenden MRL-Wertes von 100 µg/kg in Milch nachgewiesen werden. Das Antiserum zeigte nur bedingt Gruppenspezifität. Für fünf von 23 überprüften Chinolonen wurden Kreuzreaktionen von > 50 % ermittelt, von den mit einem MRL-Wert belegten Substanzen wurden Danofloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin und Oxolinsäure erfasst. Zur Überprüfung der Anwendbarkeit der entwickelten Testsysteme wurden künstlich kontaminierte und gewachsene Milch- und Garnelenproben untersucht, wobei das jeweilige Testsystem an die entsprechende Probenmatrix adaptiert wurde. Die mittlere Wiederfindungsrate lag bei 95,5 %, in keiner der Praxisproben konnten Chinolonrückstände nachgewiesen werden. Weiterhin wurde ein mikrobiologisches Verfahren unter Verwendung von E. coli als Testkeim zum Nachweis für Chinolone entwickelt. Dieser Agardiffusionstest zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Gruppenspezifität aus. Ciprofloxacin konnte mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml weit unterhalb des geltenden MRLs nachgewiesen werden, zehn weitere wichtige Chinolone wurden unterhalb von 100 ng/ml erfasst. Dieses System kann somit als nützlicher Kontrolltest verwendet werden.