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Izzo, Annalisa (2006): Characterization of MLE RNA helicase, a subunit of the Dosage Compensation Complex (DCC) in Drosophila melanogaster. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

2. Summary In Drosophila melanogaster the transcriptional activity of the male X chromosome is upregulated to compensate for the reduced dosage of X-linked genes as compared to the two X chromosomes in females. This process is mediated by the Dosage Compensation Complex (DCC), a ribonucleoprotein complex consisting of five proteins (MSL1, MSL2, MSL3, MOF and MLE) and two non-coding RNAs (roX1 and roX2). The DCC preferentially localizes on the X chromosomes in males where it doubles its transcription rate. Two enzymes are associated with the DCC: the acetyltransferase MOF, specific for the lysine 16 of H4 (H4-K16), and the DNA/RNA helicase MLE. Genetic experiments demonstrated that both activities are required for dosage compensation in male flies. However, the weak association of MLE to the DCC has complicated its biochemical analysis and, so far, the involvement of MLE RNA helicase in dosage compensation has only been demonstrated genetically. Using different in vivo and in vitro approaches the physical and functional interactions of MLE with the other MSL proteins and with the roX RNAs was addressed. Monoclonal antibodies, specifically recognizing MLE, were raised in rats, offering a new tool for MLE characterization. By coexpression of the DCC subunits in SF9 cells, a recombinant complex containing MSL1-2-3, MOF, MLE and the roX2 RNA was reconstituted and purified. A specific integration of roX2 into the DCC could be observed only in the absence of MLE. Non specific RNA binding properties seemed instead associated to MLE RNA helicase. Moreover, the purified MSL complex did not affect the ATPase activity of MLE in the presence or absence of roX2 RNA. In vitro, MLE showed a preferential association with MSL1 and MSL2 and MLE interaction with both MSL proteins were not RNA mediated. In view of these results we suggest that binding to roX2 is not the main determinant for MLE integration into the DCC complex and protein-protein interactions might instead contribute to its proper recruitment to the X chromosome. MLE is a member of the DEAD-box RNA helicase family and it shares with the other members the same domain organization. In addition to a central ATPase/helicase domain, two predicted N-terminal double strand (ds) RNA-binding motifs (dsRBM1 and dsRBM2) and a predicted C-terminal single strand (ss) RNA/DNA-binding domain (RGG-box) are also present in MLE protein. These domains have been extensively characterized in RHA, human ortholog of MLE, and their RNA binding properties confirmed. However, it is not known how MLE binds RNA and how the different RNA binding modules contribute to stimulate its enzymatic activities. A preferential binding of MLE to dsRNA compared to ssRNA was shown by binding assays. In addition, changes in the affinity of MLE for both ssRNA and dsRNA were observed in the presence of different nucleotides. Deletion mutants of MLE were produced and purified from insect cells in order to address the contribution of the different RNA binding domains to MLE enzymatic activities. By transient expression in Drosophila cells of the same deletion mutants fused to GFP, the effects of individual domains on MLE recruitment to the X chromosome were also determined. The results show that unlike RHA, the dsRB1 and the RGG domains are dispensable for MLE RNA binding and unwinding, whereas dsRB2 seems to play the major role in coordinating both activities. However, the enzymatic activities alone are not sufficient to properly target MLE to the X chromosome. These results provide new data on the functional properties of MLE RNA helicase that may help to elucidate its molecular mechanisms of action.

Abstract

1. Zusammenfassung In der Taufliege Drosophila melanogaster wird die transkriptionelle Aktivität des männlichen X Chromosoms erhöht, um die (im Vergleich zu weiblichen Zellen) verminderte Gen-Dosis X-chromosomaler Gene auszugleichen. Dieser Prozess wird durch den Dosis-Kompensationskomplex (DCC) vermittelt, einen Ribonucleoproteinkomplex, der aus fünf Proteinen (MSL1, MSL2, MSL3, MOF und MLE) sowie zwei nicht-kodierenden RNAs (roX1 und roX2) besteht. DCC bindet bevorzugt an das X Chromosom, wo er die Transkriptionsrate verdoppelt. Zwei Enzyme sind Teil des DCC: die Acetyltransferase MOF, die spezifisch das Lysin 16 des Histon H4 (H4K16) acetyliert, sowie die RNA/DNA-helicase MLE. Beide Aktivitäten sind für die korrekte Dosiskompensation in männlichen Fliegen verantwortlich. Allerdings erschwert die schwache Assoziation von MLE mit den übrigen MSL Proteinen die biochemische Analyse der Wirkung von MLE. Bislang konnte der Beitrag von MLE zur Dosiskompensation nur genetisch gezeigt werden. In dieser Arbeit werden mithilfe von verschiedenen experimentellen Ansätzen in vivo und in vitro die physischen und funktionalen Wechselwirkungen von MLE mit den übrigen MSL Proteinen, sowie mit den roX RNAs untersucht. Monoklonale Antikörper gegen MLE wurden in Ratten induziert, ein wichtiges neues Werkzeug zur Charakterisierung von MLE. Durch Co-Expression von DCC Untereinheiten in sf9 Zellen konnte ein rekombinanter Komplex rekonstituiert und gereinigt werden. Ein präferentieller Einbau von roX RNA konnte beobachtet werden, allerdings nur in Abwesenheit von MLE. In vitro konnte nur die unspezifische Bindung von MLE an RNA charakterisiert werden. Der gereinigte DCC hatte keinen Einfluss auf die ATPase Aktivität von MLE, unabhängig von der Anwesenheit von RNA. In vitro konnte eine spezifische Assoziation von MLE mit MSL1 und MSL2 beobachtet werden, die direkt und nicht durch RNA vermittelt war. Angesichts dieser Ergebnisse erscheint eine wichtige Rolle der roX2 RNA bei der Koppelung von MLE an den DCC unwahrscheinlich; vielmehr tragen Protein-Protein Wechselwirkungen zur Rekrutierung von MLE an das X Chromosom wesentlich bei. MLE gehört zur Familie der DEAD-box RNA Helicasen, mit denen es eine ähnliche Domänen-Organisation verbindet. Neben der zentralen ATPase/Helicase Domäne, werden für MLE zwei N-terminale Doppelstrang-RNA (dsRNA) Bindungsmotive (dsRBM1 und dsRBM2), sowie eine C-terminale Einzelstrang RNA/DNA Bindungsdomäne (RGG Box) aus Sequenzvergleichen vorhergesagt. Diese Domänen sind bislang im Kontext von RHA (RNA Helicase A), dem menschlichen Orthologen zu MLE, charakterisiert und ihre RNA Bindungseigenschaften bestätigt worden. Allerdings ist nicht bekannt, wie MLE an die RNA bindet und wie die verschiedenen RNA-bindenden Module zur RNA Stimulierung der ATPase beitragen. Hier konnte eine bevorzugte Bindung von MLE an doppelsträngige RNA (im Vergleich zu einzelsträngiger) in Bindungsassays beschrieben werden. Die Affinität der Helicase für RNA wird zudem durch Adenin-Nucleotide moduliert. Um den Beitrag einzelner Domänen zu den MLE Funktionen zu bestimmen, wurden eine Reihe von Deletionsmutanten von MLE in Insektenzellen hergestellt und gereinigt. Durch transiente Expression von entsprechenden MLE Derivaten als Fusionen mit GFP (Green Fluorescent Protein) wurde der Einfluss der Domänen auf die Rekrutierung von MLE and das X-Chromosom bestimmt. Im Gegensatz zu den beschriebenen Daten zu RHA erwiesen sich die RB1 und RGG als verzichtbar zur RNA Bindung und deren Entwindung, während dsRB2 eine wichtige Rolle zukommt. Zur korrekten Zielsteuerung von MLE an das X Chromosom ist allerdings die Funktionalität des Enzyms als ATPase alleine nicht ausreichend. Die hier vorgestellte Struktur-Funktionsanalyse leistet einen wichtigen Beitrag zur Beschreibung des Wirkmechanismus der RNA Helicase MLE.