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Kufner, Stefanie (2006): In vitro-Generierung dendritischer Zellen (DC) aus leukämischen Blasten bei Akuten Myeloischen Leukämien (AML) und Myelodysplastischen Syndromen (MDS) mit Hilfe eines serumfreien DC-Kultivierungsverfahrens. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Leukämische Blasten bei AML können ex vivo in DC umgewandelt werden, wodurch Anti-gen-präsentierende Zellen entstehen, welche leukämische Antigene präsentieren. Im kleineren Rahmen sollten zunächst Daten zu methodischen Vorversuchen ausgewertet werden, um bei AML und MDS unter serumfreien Bedingungen DC zu generieren. Diese me-thodischen Vorversuche an 50 AML-, 24 MDS-Patienten und 23 gesunden Probanden erga-ben, dass adhärente Zellfraktionen die DC-Ausbeute im Vergleich zu totalen MNC-Fraktionen nicht verbessern, dass bei MACS-depletierten `MNC(-)`- und aufgetauten MNC-Fraktionen niedrigere DC-Zahlen erreicht werden, und dass die DC-Ernte bei AML- und MDS-Patienten nach 10-14tägiger Kulturzeit, bei gesunden Probanden jedoch nach 7tägiger Kulturzeit höher ist. Außerdem zeigte sich, dass die Zugabe von FL die DC-Ernte erhöht, der Einsatz von autologem Plasma dagegen in vielen Fällen einen inhibitorischen Effekt auf die DC-Generierung hat. Die Kulturmedien CellGro und Xvivo erzielten vergleichbare DC-Ausbeuten. Nach Ermittlung der optimalen Zellfraktion, Kulturdauer und –zusätze, wurden serumfreie DC von 100 AML-, 55 MDS- und 38 gesunden Proben in einem 10-14-tägigem serumfreien Xvivo-Kultursystem mit GM-CSF, IL-4, FL und TNFα angezüchtet und charak-terisiert. Bei der DC-Generierung unter standardisierten Bedingungen betrug die Ausbeute der MNC-Fraktionen durchschnittlich 20% bei MDS, 34% bei AML und 25% bei gesunden Probanden. Zwischen 53-58% der DC waren reife CD83+DC. Die DC-Ernten waren in den monozytären FAB-Klassen (AML-M4/5, MDS-CMML) am höchsten, dagegen unabhängig von den zyto-genetischen Risikogruppen. Das Oberflächenmarkerprofil der DC von den AML- und MDS-Proben (einschließlich 1 MDS- und 3 AML-Zelllinien) war mit dem der gesunden DC ver-gleichbar. In parallelen Kulturansätzen konnte außerdem gezeigt werden, dass in einem `MCM-Mimic`-Medium mit PGE2 der Anteil reifer, CCR7+DC besonders hoch war. Der leu-kämische Ursprung der AML- und MDS-DC wurde bei 5 AML- und 4 MDS-Fällen mittels FISH durch die Persistenz klonaler, zytogenetischer Aberrationen in den DC oder in übrigen Fällen durch die Coexpression leukämischer Antigene auf den DC bewiesen. Durch eine kombinierte FISH/Immunophänotyp-Analyse (FISH-IPA) konnte zudem nachgewiesen wer-den, dass obige klonale, numerische Aberrationen konstant in Kombination mit DC-Markern detektierbar, jedoch nicht alle klonalen Zellen zu leukämischen DC umwandelbar waren (durchschnittlich 53% der AML- und MDS-Blasten). Umgekehrt trugen auch nicht alle gene-rierten DC die klonale Aberration (im Durchschnitt 51% der DC). In 41 AML-Fällen mit ei-ner Leukämie-spezifischen bzw. aberranten Antigenexpression oder in AML-Fällen mit ei-nem CD33+ Blastenphänotyp und gleichzeitig <5% CD14+-Zellen sowie in 13 MDS-Fällen mit einer detektierbaren CD34+- oder CD117+-Blastenpopulation konnten die FISH-IPA-Daten durchflusszytometrisch bestätigt werden. Auch hier zeigte sich, dass, obwohl leukämi-sche DC konstant nachweisbar waren, durchschnittlich ca. 50-65% der Blasten bei AML und MDS zu leukämischen DC konvertiert werden konnten, sowie nur ca. 50-60% der detektierten DC nachweislich leukämischen Ursprungs waren. Deshalb empfiehlt sich möglicherweise, leukämische DC für zukünftige Impfungen zu selektionieren, um Kontaminationen durch nicht umgewandelte Blasten, die eine T-Zellantwort inhibieren könnten, oder durch nicht-leukämische DC, die Autoimmunreaktionen verursachen könnten, zu vermeiden bzw. alterna-tiv die stimulatorische Effizienz der generierten DC funktionell zu testen. In 6% der AML- und in 31% der MDS-Fälle waren <10% der DC generierbar. Möglicherweise können bei die-sen Fällen mit anderen Generierungsmethoden ausreichende Mengen von DC generiert wer-den. In gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) konnten wir eine Aktivierung und Proli-feration autologer T-Zellen nach DC-Kontakt zeigen sowie in zwei Fällen mit AML-M0 und AML-M1 zytotoxische T-Zellen generieren, die fähig waren, naive Blasten im Fluorolyse-Assay zu lysieren. In 4 Fällen mit nur wenigen leukämischen DC oder vitalen T-Zellen nach der DC/MLR-Prozedur wurde keine Lyse der leukämischen Zellen nachgewiesen, was die bedeutende Rolle beider Partner bei dem Lyseprozess herausstellt. Die wichtigsten Erkenntnisse dieser Arbeit waren: 1, Die serumfreie Generierung leukämischer DC unter serumfreien Kulturbedingungen ist bei AML sowie bei MDS aus Blasten möglich. 2, DC können nicht bei allen Patienten mit der von uns untersuchten Methode generiert wer-den. 3, Die Konvertierungseffizienz leukämischer Zellen zu DC leukämischer Abstammung ist variabel. 4, T-Zellen von AML-/ MDS-Patienten sind durch autologe DC dieser Patienten aktivierbar, sie proliferieren und bringen zytotoxische Zellen hervor, die naive Blasten lysieren können. Somit stellen aus leukämischen Zellen generierte DC bei AML und MDS möglicherweise ein interessantes immuntherapeutisches Medium dar, um autolog oder allogen die spezifische an-tileukämische Immunantwort zu verbessern.