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Meister, Gunter (2002): Biogenese der spleißosomalen UsnRNPs: Charakterisierung eines faktorvermittelten Zusammenlagerungsprozesses von RNA-Protein-Komplexen. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) sind Komplexe aus RNA und Proteinen, die entscheidende Funktionen bei Prozessen wie Translation, Telomer-Synthese, Protein-Import in das endoplasmatische Retikulum oder RNA-Prozessierung übernehmen. Obwohl stets neue Beispiele die Bedeutung von RNPs untermauern, sind grundlegende Aspekte ihrer Funktion noch unklar. So stellte sich zu Beginn dieser Arbeit die Frage, wie sich die Komponenten von RNPs zu funktionellen Gebilden zusammenlagern. In frühen in-vitro-Studien war beobachtet worden, dass sich RNPs spontan ausbilden und dieser Vorgang keine weiteren Faktoren benötigt. Daraus war die Hypothese abgeleitet worden, dass dies möglicherweise auch der in vivo Situation entsprechen könnte. Unerwartete Einblicke in die Biogenese von RNPs lieferten schliesslich Studien zum "survival motor neurons"-Protein (SMN), dem Krankheitsgenprodukt der spinalen Muskelatrophie. Antikörper gegen SMN und seinem Bindungspartner Gemin2 inhibierten in Xenopus laevis Oocyten die Ausformung von RNP-Untereinheiten des Spleißosoms - den U snRNPs und nährten den Verdacht, dass diese Proteine Hilfsfaktoren der U snRNP-Biogenese sein könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, mechanistische Details über die Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo zu ermitteln und die Rolle von SMN und Gemin2 zu untersuchen. Die wesentlichen Schritte der Biogenese von U snRNPs können experimentell in X. laevis Oocyten verfolgt werden. Nach dem Export der U snRNAs U1, U2, U4 und U5 in das Cytosol lagern sich dort jeweils sieben sogenannte Sm-Protein an ein gemeinsames Motiv der U snRNAs an und formen so die Grundstruktur jedes U snRNPs, die Sm-Core-Domäne. Hierauf folgen die Hypermethylierung der U snRNA-Kappe und der Import der Sm-Core-Domäne in den Zellkern, wo sich U snRNP-spezifische Proteine anlagern, ehe die reifen snRNPs am Spleißprozess teilnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein zellfreies System entwickelt, durch das die Zusammenlagerung von U snRNPs in der Komplexität des Cytosols untersucht werden konnte. Unter Verwendung von Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern oder HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, entgegen bisheriger Vermutungen, nicht spontan erfolgt, sondern Energie in Form von ATP benötigt. Aus Depletionsversuchen wurde deutlich, dass SMN unter diesen zellähnlichen Bedingungen für die snRNP-Biogenese unbedingt erforderlich ist. SMN, dies zeigten immunbiochemische Reinigungen, ist in der Zelle mit 17 verschiedenen Proteinen assoziiert, die hier erstmals vollständig identifiziert wurden. Dieser SMN-Komplex enthält bereits alle Sm-Proteine, jedoch keine U snRNAs. Anhand direkten Sm-Protein-Transferstudien wurde klar, dass der SMN-Komplex allein nicht nur notwendig sondern auch hinreichend für die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, ist. Dennoch konnte mit dem pICln-Komplex ein Proteinkomplex entdeckt werden, der mit dem SMN-Komplex interagiert und dessen Aktivität erheblich steigert. Der pICln-Komplex enthält eine neuartige Methyltransferase, die Arginylreste in den Sm-Proteinen B/B’, D1 und D3 zu symmetrischen Dimethylargininen modifiziert. Es ist bekannt, dass hierdurch die Bindung von Sm-Proteinen an SMN verstärkt wird. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass SMN- und pICln-Komplexe eine funktionelle Einheit bilden, in der Modifikation und Transfer der Sm-Proteine koordiniert ablaufen. Erste Erkenntnisse aus Versuchen mit HeLa-Zellen und Patientenzelllinien deuten an, dass reduzierte Menge des SMN-Komplexes mit einer reduzierten U snRNP-Zusammenlagerungsaktivität einhergehen, und dass dies einen biochemischen Defekt in Spinaler Muskelatrophie darstellen könnte. In einem weiteren Projekt wurde mit Hilfe von Datenbankanalysen und biochemischen Strategien das SMN-homologe Protein SMNrp identifiziert und charakterisiert. Biochemische Studien zeigten, dass SMNrp eine Komponente des U2 snRNPs ist und eine essentielle Rolle beim Spleißen ausführt. Kernextrakte die kein SMNrp enthalten wiesen einen Defekt der Spleißosomen-Zusammenlagerung auf der Stufe des „prä-Spleißosoms“ auf. SMNrp ist demnach ein Zusammenlagerungsfaktor des Spleißosoms und bezüglich dieser Funktion dem U snRNP-Zusammenlagerungsfaktor SMN ähnlich.